Биофизика фотобиологических процессов

А.Б.Рубин, О.Р.Кольс, Т.Е.Кренделева и др.

Одной из важнейших фундаментальных проблем биофизики является расшифровка механизмов первичных процессов действия света на разные биологические системы. Свет является одним из ключевых факторов среды обитания большинства организмов. Рецепция света и трансформация его энергии лежит в основе зрения, фотосинтеза и ряда фоторегуляторных процессов у растений, в инициации которых участвуют специализированные фоторецепторы, например, родопсин, хлорофилл, фитохром, фототропин, криптохром. Поглощая свет определенного спектрального диапазона, фоторецепторы вступают в фотохимические реакции с образованием первичных фотопродуктов. Последние участвуют в биохимических процессах клеточной регуляции, что приводит к развитию конечных фотобиологических эффектов. В то же время свет индуцирует протекание в клеточных структурах различных деструктивных фотохимических реакций, природа и эффективность которых зависит от длины волны и интенсивности излучения, наличия соответствующих фотоактивных хромофоров и их внутриклеточной локализации, а также способности клеток к фотозащите и репарации фотоповреждений. Наиболее эффективно деструктивные реакции индуцируются высокоэнергетическим ультрафиолетовым (УФ) излучением (‹290 нм). Экологическими компонентами оптического излучения солнца яаляются средневолновый УФ (СУФ, 290—320 нм), длинноволновый УФ (ДУФ, 320—400 нм) и видимый свет (400—700 нм). Уменьшение концентрации стратосферного озона ведет к повышению интенсивности СУФ, который за счет прямого поглощения нуклеиновыми кислотами и белками вызывает образование в них повреждений, обусловливающих цитотоксические, мутагенные и канцерогенные эффекты. ДУФ и видимый свет, которые макромолекулами непосредственно не поглощаются, могут индуцировать деструктивные реакции за счет фотосенсибилизации с участием эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов (хромофоров), способных в фотовозбужденном состоянии реагировать с биосубстратами с образованием реакционноспособных радикалов или генерировать активные формы кислорода, вызывающие окислительный стресс.

Молекулярная фотобиология

Исследования в этой области связаны с изучением фундаментальных механизмов воздействия света на клетки дрожжей и бактерий. Основная проблема состоит в выявлении фотоиндуцированных реакций и изучении природы светочувствительности живой клетки при воздействии оптического излучения. В центре внимания — экспериментальное решение следующих вопросов:

какие потенциально фотоактивные хромофоры (сенсибилизаторы) могут вступать в фотохимические реакции в клетке, не содержащей специализированные фоторецепторные системы;

какова природа первичных фотопродуктов, ответственных за развитие конечного фотобиологического эффекта;

какое значение для протекания фотореакций и проявления эффекта имеют внутриклеточная локализация фотоактивного хромофора и его молекулярное микроокружение;

какие механизмы могут лежать в основе фотоиндуцированной модификации цитотоксических эффектов оптического излучения, которая наблюдается при комбинированных воздействиях света разной длины волны и интенсивности.

Исследования, проведенные на клетках дрожжей, позволили обнаружить, что низкоинтенсивный монохроматический свет в диапазоне 290—380 нм индуцирует два различных фотобиологических эффекта в зависимости от дозы облучения: фотозащиту от УФ-инактивации и фотостимуляцию размножения клеток. Оба эффекта основаны на фотомодуляции активности фермента, катализирующего синтез серотонина — метаболита, у которого были обнаружены ранее не известные функции — протектора ДНК от УФ-повреждений и регулятора клеточного деления. При более высоких интенсивностях и дозах ДУФ- излучение вызывает летальный эффект, в основе которого лежат фотодинамические реакции. Показано, что функцию эндогенного сенсибилизатора выполняет локализованный в ядре клетки НАДН. Установлена способность НАДН фотогенерировать супероксидный анион-радикал кислорода с последующим образованием перекиси водорода и гидроксильного радикала, который непосредственно участвует в формировании одноцепочечных разрывов ДНК. Кратковременное воздействие видимого света в малых дозах (максимум эффективности в красной области спектра при 680 нм) индуцирует защитный эффект в условиях инактивирующего облучения клеток СУФ и ДУФ. Установлено цитотоксическое действие видимого света, опосредованное эндогенным сенсибилизатором протопорфирином. В условиях индуцированного накопления в митохондриях клетки высокого уровня сенсибилизатора и последующей его релокализации в плазматическую мембрану и ядро наблюдается многократное увеличение летального эффекта вследствие взаимодействия деструктивных процессов, протекающих в этих структурах.

В качестве первоочередной задачи при изучении молекулярного механизма обнаруженного фотозащитного эффекта, индуцированного красным светом, необходима идентификация фоторецептора, опосредующего этот эффект. Полученные ранее данные дают основания предполагать, что фоторецептором в дрожжевой клетке может служить хромопротеид, аналогичный фитохрому — универсальному фоторегуляторному пигменту растений. У микроорганизмов функциональная роль фитохрома пока не определена, хотя гены, кодирующие апофитохром, недавно найдены у некоторых бактерий и грибов. Другая задача связана с изучением молекулярных основ фотосенсибилизирующей активности и фотолабильности эндогенного протопорфирина, участвующего в фотодинамической инактивации дрожжевых клеток, в зависимости от молекулярного микроокружения.

Молекулярные механизмы фотосинтеза

Важнейшей фундаментальной проблемой биофизики является изучение фотосинтеза — процесса преобразования световой энергии солнца в химическую энергию тканей фотосинтезирующих организмов. В первичной (световой) стадии энергия поглощенных квантов света используется для разрыва химических связей восстановителя (в случае высших растений — для фотолиза воды), а часть ее, в конечном счете, запасается в новых химических связях. В последующей (темновой) стадии фотосинтеза запасенная энергия используется для восстановления углекислоты до сахаров в восстановительном пентозофосфатном цикле, осуществлящем создание органического вещества из неорганического. Первичные процессы фотосинтеза включают несколько этапов: поглощение света хлорофиллом антенного комплекса, миграцию энергии поглощенных квантов к реакционным центрам (РЦ) фотосистем, фотохимическое разделение зарядов, перенос электронов по фотосинтетической электрон-транспортной цепи, сопряженный с запасанием энергии в виде химических связей конечного восстановленного продукта — восстановленного НАДФ, а также АТФ.

Поскольку разные этапы первичных процессов фотосинтеза протекают в разных компартментах фотосинтетической мембраны и характеризуются различными временами, для понимания механизма процесса фотосинтеза необходимы исследования, проводимые специалистами разного профиля и использованием объектов разной сложности — от изолированных макромолекулярных белковых и пигмент-белковых комплексов, различных субхлоропластных частиц, хлоропластов, фотосинтезирующих клеток водорослей до нативных растений. Это требует сотрудничества фотофизиков, биохимиков и физиологов растений. Кроме того необходима лабораторная техника, позволяющая исследовать процессы в разном временнóм диапазоне.

Ключевой энергопреобразующей структурой в фотосинтезирующих организмах являются реакционные центры фотосистем, встроенные в фотосинтетические мембраны пигмент-белковые комплексы, выполняющие за счет энергии света высокоэффективный (квантовый выход — до 100 %) и очень быстрый (менее 1 нс) трансмембранный перенос электронов против направления термодинамического потенциала, в результате чего, в конечном итоге, и запасается солнечная энергия.

В проводимых исследованиях используются различные современные методы кинетической абсорбционной и люминесцентной спектрофотометрии широкого временного диапазона регистрации, ЭПР, ЯМР, ядерный гамма-резонанс, современные подходы теоретического анализа получаемых результатов и построения адекватных физических моделей процессов. Имеется биохимическая база для получения высокочистых активных фотосинтетических препаратов различного состава, включая изолированные мембранные белково-пигментные комплексы разного уровня организации. Основными методами изучения механизмов преобразования световой энергии в первичных стадиях фотосинтеза являются:

измерение кинетик затухания флуоресценции (импульсная флуориметрия) с временным разрешением до 10 —12 с;

лазерная абсорбционная спектроскопия фемто-, пико- и наносекундного (10 —14 — 10 —8 с) диапазона, позволяющая исследовать последовательность и скорости реакций преобразования энергии кванта света в энергию электрохимического потенциала;

спектроскопия комбинационного рассеяния света, позволяющая изучать природу химических связей синтезированных под действием света соединений;

широкий спектр традиционных методов оптической спектроскопии, спектроскопии переходных процессов, компьютерного моделирования и радиоспектроскопии.

Методами импульсной флуорометрии и абсорбционной спектроскопии высокого (10 —14 — 10 —8 с) временного разрешения исследуются процессы миграции энергии электронного возбуждения в антенных пигмент-белковых комплексах, захвата возбуждения фотоактивным пигментом РЦ — первичным донором электрона, и темновые реакции разделения зарядов и переноса электрона в акцепторной цепи электронного транспорта. Показано, что белки, содержащие пигменты антенны и кофакторы, за времена менее 10 —12 с способны осуществлять тонкую подстройку начальных и конечных состояний донора и акцептора энергии (электрона). В самый начальный момент времени возникает неравновесное начальное состояние донора энергии (электрона). В результате процесса сольватации с участием водородных связей происходит понижение уровня энергии донора и формирование наиболее выгодной конфигурации потенциальной поверхности для реактантов. Как следствие, вероятность обратных (бесполезных) реакций падает, а эффективность прямых энергетически выгодных реакций существенно возрастает.

Наноразмерные синтетические энергопреобразующие системы

Базовые принципы высокоэффективного преобразования световой энергии при фотосинтезе легли в основу создания синтетических энергопреобразующих структур на основе порфиринов. Сконструированы различные химические структуры, способные к 1% межмолекулярному (диады) и внутримолекулярному (димеры) переносу энергии электронного возбуждения от донора к акцептору. В этих синтетических трехкомпонентных системах (безметалльный порфирин — Zn порфирин — хинон) осуществлена последовательность событий, реализуемых в фотосинтезирующих организмах: поглощение света → миграция энергии → разделение зарядов. Такие синтетические структуры могут стать прообразом искусственных энергопреобразующих устройств будущего.

Перспективы (как в фундаментальном, так и в прикладном аспекте) связаны с возможностью создания гибридных наноразмерных биоэнергетических и биосенсорных устройств. Фотосинтетический реакционный центр является природным наноструктурным образованием. Именно специфика протекания фотофизических и фотохимических процессов в наноразмерных структурах объясняет уникальные энергопреобразующие свойства фотосинтетических РЦ. Гибридные устройства типа: РЦ — нанотрубка или молекулярный провод — электрод — внешняя электрическая цепь могут стать прообразом биоэлектрических генераторов энергии.

Бактериородопсин

Эволюционно наиболее ранним фотопреобразующим комплексом является белок бактериородопсин, осуществляющий светоиндуцированный трансмембранный перенос протонов, создающих «движущую силу» для последующего синтеза АТФ. Этот белок, выполняющий в настоящее время функцию так называемого «бесхлорофильного» фотосинтеза у некоторых видов архебактерий, чрезвычайно устойчив к различным воздействиям. Физические механизмы функционирования данного фотопреобразующего комплекса привлекают самое пристальное внимание исследователей в течение последних десятилетий.

В проводимых на кафедре биофизики работах было показано, что конформационная подвижность фототрансформирующих белков, как и в случае классических ферментов, играет ключевую роль в их функционировании. Ее роль проявляется, начиная с пикосекундных стадий переноса электрона, в которых микроконформационная динамика обеспечивает быстрые релаксационные процессы, сопровождающие эффективную временную стабилизацию первичного разделения заряда. Гораздо более медленные конформационные изменения, приводящие к формированию выделенных структурных состояний макромолекулярного комплекса, контролируют направленность и скорость дальнейшего переноса зарядов. Была показана важнейшая роль состояния внутримолекулярных водородных связей в указанных процессах.

Детальное изучение влияния температурного фактора на первичные фотофизические процессы превращения световой энергии позволило сформулировать концепцию фотоконформационного перехода как эффективного механизма регуляции скорости переноса электронов в фоточувствительной макромолекулярной структуре.

Иммобилизация этих белков в полимерных матрицах, формирование на их основе тонких ориентированных пленочных структур, включение полупроводниковых и других электропроводящих компонентов в создаваемые конструкции открывает широкие возможности изучения практического применения белков РЦ и бактериородопсина. Имеется приборная база для формирования и изучения свойств упорядоченных моно- и мультислойных многокомпонентных пленочных конструкций с участием фоточувствительных белков (техника Ленгмюра- Блоджетт, атомно-силовая и туннельная микроскопия, электрохимический анализатор).

Кислород-выделяющий комплекс хлоропластов (КВК)

Фотохимическое разделение зарядов в РЦ фотосистем индуцирует транспорт электронов в ЭТЦ фотосинтеза. У высших растений и водорослей донором электронов является вода. Побочный продукт окисления воды, кислород, выбрасывается в атмосферу, его накопление в атмосфере привело к ее радикальной трансформации и послужило фундаментом для развития многочисленных форм животных. Процесс, сопровождающийся фотоокислением воды с выделением кислорода, называется оксигенным фотосинтезом, и начальные его стадии (окисление воды) осуществляются в пигмент-белковом комплексе фотосистемы II. Поглощение света ФС II сопряжено с работой каталитического центра — кислород выделяющего комплекса. КВК состоит из 4 катионов марганца и 1 катиона кальция. Фундаментальная роль данного металлофермента в функционировании биосферы определяет высокую интенсивность исследований механизмов работы КВК и ФС II. Однако, несмотря на значительные успехи в понимании основ функционирования ФС II, работа ее ключевого звена, КВК, все еще остается неясной.

В проводимых в настоящее время исследованиях ФС II широко используются новейшие методы, применяемые в передовых областях биофизики, биохимии, молекулярной биологии, нанотехнологии для изучения каталитических центров металлоферментов, механизмов внутри- и межмолекулярного переноса электрона, структурной организации и функционирования наноструктур. К ним можно отнести различные методы регистрации флуоресценции, рентгеноструктурный анализ, точечный мутагенез, компьютерное моделирование структуры, рентгеновскую спектроскопию, ЭПР, инфракрасную спектроскопию с Фурье разложением и т.д. Исследования КВК, проводимые на кафедре биофизики, направлены на выяснение структурной организации КВК с использованием разработанного метода замещения катионов марганца на катионы железа, а также роли кофакторов КВК — катионов кальция и анионов хлора — в окислении воды.

Проблемы регуляции первичных процессов фотосинтеза

Фотосинтетический аппарат имеет сложную многоуровневую систему регуляции, которая должна обеспечивать эффективное использование энергии света, а также сопряжение световых и темновых процессов фотосинтеза. Существует целая иерархия регуляционных механизмов, зависящих от физиологического состояния и изменений среды, которые условно можно разделить на «медленные» и «быстрые». «Медленные» предполагают перестройку и изменение структуры хлоропласта и его компонентов, их действие связано с включением генетического аппарата и синтезом новых белков, для чего требуется определенное время (минуты, часы). Эти процессы зависят от работы регуляторных белков, которые активируются под действием света.

Механизмы «быстрой» регуляции, ответственные за динамические изменения в функционировании отдельных участков фотосинтетической цепи, с синтезом белка не связаны. Они основаны на изменениях констант взаимодействия переносчиков, например, вследствие изменения их конформации, и направлены на недопущение перевосстановленности ЭТЦ при высоких освещенностях. Из результатов исследований последних лет, проводимых на кафедре биофизики, можно предполагать, что следствием наличия гибкой системы регуляции является защита от окислительных повреждений, а целью быстрой регуляции электронтранспортных процессов фотосинтеза — создание оптимального состояния ЭТЦ, когда нет избытка или недостатка электронов на определенных ее участках, что позволяет защитить фотосинтетические мембраны от фотодеструкции.

Наличие большого числа акцепторов электронов открывает дополнительные возможности для регуляции электронного потока и систем ассимиляции СО2 и азота, что необходимо для обеспечения процессов синтеза белка в хлоропласте. Кроме того, существование альтернативных путей сброса электронов препятствует «перевосстановлению» компонентов, поддерживая их в определенном редокс-состоянии.

Существует несколько механизмов, защищающих фотосинтетические мембраны от фотоповреждения. Важную роль играет нефотохимическое тушение возбужденных состояний хлорофилла, этот механизм связан с образованием трансмембранного ΔрН, а также работой виолоксантинового цикла. Вся не использованная в фотосинтезе энергия поглощенных квантов света рассеивается в виде тепла или излучается в виде флуоресценции. Увеличение рассеивания энергии в виде тепла уменьшает количество актов разделения зарядов в РЦ и, соответственно, приводит к уменьшению потока электронов в ЭТЦ. Подавляющая часть флуоресценции, наблюдаемой при изучении листьев высших растений или суспензий зеленых водорослей, генерируется в ФС II. В настоящее время параметры флуоресценции широко используются в фундаментальных и прикладных исследованиях как показатель состояния и эффективности функционирования фотосинтетического аппарата. Основная идея состоит в том, что уменьшение эффективности запасания света в фотосинтезе приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Изменения состояния фотосинтетического аппарата сопровождаются изменением вероятности тушения энергии электронного возбуждения молекул хлорофилла, что и проявляется в изменении квантового выхода и времени затухания флуоресценции.

Фотоиндуцированное выделение водорода

Перспективным направлением исследований является фотоиндуцированное выделение водорода эукариотическими микроводорослями — еще один механизм регуляции первичных процессов фотосинтеза. Этот удивительный процесс был открыт более 60 лет назад и активно используется в биотехнологических целях, однако в понимании молекулярных механизмов и принципов регуляции процесса есть еще много белых пятен. Водород выделяется гидрогеназой — ферментом, восстанавливающим протоны до молекулярного водорода. Непосредственными донорами электронов в гидрогеназной реакции являются ферредоксин или НАДФ. Таким образом, фотоиндуцированное выделение водорода тесно связано с работой фотосинтетической ЭТЦ, но непременным условием этого процесса является отсутствие кислорода, который ингибирует активность фермента даже при очень низких концентрациях.

Как биотехнологический прием для разделения во времени процессов фотосинтетического выделения О2 и светозависимого выделения Н2 можно использовать серное голодание культуры водорослей. Изучение влияния серного голодания на клетки Chlamydomonas reinhardtii в аэробных условиях (когда гидрогеназа неактивна) показало, что при недостатке серы происходит инактивация катализируемого ФС II выделения О2 . В замкнутом культиваторе культура микроводоросли на свету в отсутствие серы в среде проходит несколько последовательных стадий. Сначала идет активное выделение O2, затем активность ЭТЦ фотосинтеза снижается, и процессы дыхания начинают преобладать над процессами фотосинтеза. Когда скорость фотосинтетического образования O2 становится ниже скорости дыхания, культура переходит в анаэробные условия, и через некоторое время начинается выделение H2.

О том, что происходит с фотосинтетическим аппаратом при прохождении всех этих стадий, можно судить по параметрам флуоресценции хлорофилла. Изучение динамики активности ФС II Chlamydomonas reinhardtii в культиваторе показало, что переход в анаэробиоз сопровождается резким падением активности ФС II, по времени совпадающим с началом выделения водорода. Активацию гидрогеназы в анаэробных условиях можно рассматривать как адаптивный механизм, который увеличивает отток электронов на водород, что снижает степень восстановленности пула хинонов и реактивирует часть центров ФС II. Это способствует частичному сохранению фотосинтетического электронного транспорта в голодающих клетках и обеспечивает их некоторым количеством кислорода, что позволяет некоторое время оставаться жизнеспособными в условиях стресса. Временное частичное повышение скорости электронного транспорта вызывает реокисление пула хинонов, что видно по изменению индукционной кривой флуоресценции. Эти результаты показывают, что изменение редокс-состояния пула хинонов — способ регуляции ЭТЦ при смене условий.

Весьма перспективным при прояснении вопроса о роли фотосистемы II в процессах выделения водорода является использование мутантов с сайт-специфичными повреждением в ФС II. Были использованы мутанты водоросли C. reinhardtii, обладающие различной кислород-выделяющей активностью. Представлялось, что частичная потеря кислородвыделяющей активности будет иметь следствием ускорение перехода в анаэробные условия, но не должна отрицательно сказаться на скорости продукции Н2 . Однако оказалось, что, чем больше повреждена способность ФС II к выделению О2 , тем сильнее снижена способность к выделению водорода. Изучение динамики накопления и расхода метаболитов (крахмала, формата и ацетата) в разных мутантах в ходе серного голодания показало, что образование водорода в большей, чем ожидалось, степени коррелирует с активностью ФС II. Эти исследования могут быть основой для разработки биотехнологических приемов для увеличения выхода Н2 .