Перенос чужеродной ДНК в протопласты

Реферат по биотехнологии

"Перенос чужеродной ДНК в протопласты. Повышение стабильности протопластов"

Введение

Фитобиотехнология – составная часть биотехнологии, объектами которой являются клетки и ткани растений – фотоавтотрофных эукариот, а также биоактивные молекулы растительного происхождения (ферменты, нуклеиновые кислоты, стероиды и некоторые другие сложные органические вещества).

Название фитобиотехнология слагается из четырех слов греческого происхождения: phyton – растение, bios – жизнь, teken – искусство, logos – наука, слово. Следовательно, это наука об использовании растительных объектов в технике и промышленном производстве.

На первый взгляд выращивание растений (злаковых, лекарственных, декоративных и т.д.) в полевых условиях подпадает под рубрику «фитобиотехнология», однако, как и с животными, здесь отсутствуют специфические методы промышленного культивирования цельных растений в биореакторах.

Таким образом, к фитобиотехнологическим процессам относят те из них, которые базируются на клеточном уровне, если даже клетки несут генетическую информацию, воспринятую ими в результате генно-инженерного эксперимента.

Клетки и ткани высших растений, выращиваемые на питательных средах in vitro в строго контролируемых условиях, все шире используют в фитобиотехнологии.

Общирное царство растений – потенциально неограниченный источник клеток и тканей, которые могут быть введены в культуру и, как следствие, существуют неограниченные возможности для создания новых фитобиотехнологических процессов, в которых нуждается человечество.

1. Общие сведения о фитобиотехнологии

В настоящее время царство растений на земном шаре включает порядка 300 000 видов. От рационального и бережного отношения к растениям зависит благополучное выживание человечества на планете Земля.

Хотя растительные клетки и ткани принадлежат к более дифференцированным организмам в сравнении, например, с бактериями, тем не менее, они способны культивироваться в форме неорганизованной клеточной массы – каллуса.

Каллусную ткань можно «заставить» формировать зародышеподобные структуры, почки, побеги, а на их основе – растения-регенераты. Все это происходит благодаря тотипотентности растительных клеток (от лат. totus – все, целый, potentia – сила, потенция). Понятие «тотипотентность» является клеточной характеристикой; в нем отражен потенциал клетки воспроизводить все типы клеток, присущих взрослому организму. Другими словами клетка обладает способностью воспроизводить целый организм.

Если в качестве биообъекта применяют изолированный зародыш, меристему верхушечных или пазушных почек, то есть интегрированную систему, то все получаемые растения-регенеранты будут полностью соответствовать исходному растению, из которого была взята какая-либо интегрированная система из числа вышеназванных. Этим добиваются клонирования интересующих настоящих растений. (2)

В случаях применения изолированных клеток и протопластов удается получать измененные варианты исходной формы, которые передают полученные новые признаки потомству. Этим добиваются возможностей искусственного создания новых форм растений, пригодных для выборки, или селекции (см. рисунок ниже).

В течение последних лет биотехнологам удалось массовое размножение культивируемых растений с уникальными характеристиками, а выращивание растительных клеток стало основой для получения многих природных веществ, образуемых различными растениями в качестве продуктов вторичного обмена (гликозиды, алкалоиды и другие вещества).

Таким образом, клеточная и молекулярная биология растений составляет основу фитобиотохнологии, а главными направлениями стали создание новых форм полезных растений для сельского и лесного хозяйства, а также разработка промышленного производства химических веществ из растений.

2. Протопласты. Характеристика и получение

Растения – как многоклеточные организмы с огромной емкостью геномов, с половым путем размножения и многоступенчатыми программами развития – являются более сложными объектами для генноинженерных экспериментов, чем, например, вирусы, бактерии и дрожжи.

Тем не менее, уже теперь достигнуты определенные успехи с растительными объектами и по прогнозам ученых США к 2010 году ожидается прирост урожайности сельскохозяйственных культур примерно на 60–70% по сравнению с началом 80-х годов текущего столетия в основном на основе использования методов генетической инженерии, когда стал возможным перенос отдельных генов от одного растения другому (в противоположность естественному половому процессу, при котором происходит замена целых блоков сцепленных генов).

Протопласты (от греч. protos – первый, plastos – вылепленный, образованный) – это клетки, лишенные клеточных стенок, способные сохраняться и метаболизировать, равно как и реконструировать клеточную стенку в подходящих условиях.

Протопласты можно получать с помощью механических и биохимических (энзиматических) методов. В первых случаях добиваются плазмолиза растительных тканей, например, с помощью 0,1% раствора сахарозы с последующим разрезанием эпидермиса и освобождением протопластов в окружающую питательную среду.

Энзиматические методы по-разному эффективны в получении протопластов. Здесь необходимо подбирать ферменты для каждого вида растений, однако наиболее часто используют целлюлазы, пектиназы, гемицеллюлазы как индивидуально, так и в комбинациях. Например, для получения протопластов из листьев Nicotiana tabacum листовую ткань без эпидермиса погружают в смесь ферментов, включающую 0,5% пектиназы и 2% целлюлазы в 0,7 М растворе маннита или сорбита; для получения протопластов из листьев клевера и люцерны используют 2–5% смесь гликаназ с пептидазами, и т.д. (5)

В сравнительном плане более подходящим является энзиматический метод получения протопластов как более щадящий. Однако при любом способе важен подбор осмотического стабилизатора, без которого может наступить быстрый плазмоптиз протопластов (по лат. plasma – плазма, option – альтернатива). В качестве таких стабилизаторов могут быть применены растворы неорганических солей (СаСl₂, КСl, NaHPO₄), органических гликолей (маннита, сорбита), моно- и дисахаридов (глюкозы, ксилозы, сахарозы) в ориентировочных концентрациях 0,3–0,8 М/л. Однако применительно к виду растения, из которого получают протопласты, необходимо подбирать индивидуальные условия для «протопластирования» (осмотический стабилизатор, рН среды). Эти требования сохраняются и в случаях получения протопластов из каллусных культур и клеточных суспензий.

В жизнеспособности выделенных протопластов большую роль играет физиологическая полноценность исходного растительного материала. Суспензионные культуры наиболее приемлемы для этих целей, будучи в конце логарифмической фазы роста (размножения).

Полученные тем или иным путем протопласты либо используют для регенерации растения, либо их можно подвергнуть слиянию с образованием гетерокариотических гибридов.

Из растений, относительно легко регенерирующих из протопластов, можно назвать картофель, люцерну, маниок, рапс, табак. Для получения растений – регенерантов, высаженных в грунт, требуется, как минимум, 16–18 недель.

Растения, полученные из протопластов, могут отличаться достаточно выраженной изменчивостью по ряду интересующих нас признаков: урожайности, величине (размеру), морфологии отдельных частей, фотопериодичности и др. Как правило, это связывают с изменением числа и перестройками хромосом. Поэтому протопласты растений представляют собой интересные объекты и для изучения процессов мутагенеза.

Гибридизация протопластов удается не только в тех случаях, когда исходные растения (источники клеток для протопластирования) способны гибридизоваться половым путем, но и тогда, когда заведомо известно, что клетки, подлежащие слиянию, относятся к организмам с половой несовместимостью. Тем не менее, во всех случаях соматической гибридизации один из партнеров должен нести какой-либо маркерный признак (биохимический или другой), по которому возможно подтвердить достоверность получения гибрида. В этом смысле удобны ауксотрофные мутанты.

Гетерокариотические соматические гибриды выделяют либо вручную с помощью микроманипулятора, капиллярной пипетки и шприца, либо автоматически на основе применения флуоресцентных систем.

Для биотехнологии также важна цибридизация, когда возникают гетерозиготы по внеядерным (цитоплазматическим) генам, определяющим, например, устойчивость к гербицидам или признак цитоплазматической мужской стерильности (рисунок).

К настоящему времени из ряда растительных протопластов получены их безъядерные фрагменты – микропласты,окруженные тонопластной мембраной и включающие часть внеядерного генетического материала. Используя приемы соматической гибридизации, микропласты можно сливать с реципиентными протопластами. (1)

Таким образом, микропласты являются резервным материалом для расширения возможностей клеточной инженерии в фитобиотехнологии. Более того, теперь удается гибридизация растительных протопластов с протопластами микроорганизмов и животными клетками.

Применительно к хромосомной инженерии удалось доказать проникновение изолированных метафазных хромосом в обработанные полиэтиленгликолем реципиентные протопласты таких однодольных растений, как пшеница и кукуруза.

Также открываются пути привнесения дополнительной генетической информации по желанию экспериментатора в целях создания трансгенных растений. Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен также с помощью микроинъекции, трансформации, упаковки в липосомы с последующим их эндоцитозом растительными протопластами, и электропорации (высоковольтных электрических импульсов).

3. Перенос чужеродной ДНК в протопласты

Проблема создания векторов для введения чужеродной ДНК в протопласты растений является наиболее сложной. Здесь наметились следующие подходы:

1) использование плазмид бактерий, заражающих растения в естественных условиях; при этом часть плазмиды встраивается в ядерный геном растения-хозяина и функционирует в составе его генома;

2) использование бактериальных плазмид, «сшитых» с фрагментами ДНК хлоропластов или митохондрий растений, для создания челночных векторов, способных к репликации в клетках прокариот и экспрессии в эукариотических клетках;

3) использование ДНК-содержащих вирусов растений; в такой системе ДНК функционирует автономно от генома растения-хозяина.

Для переноса чужеродной ДНК в растения наиболее широко используется агробактериальная трансформация с помощью бинарных плазмидных векторов.

Практикуются также методы переноса генов в растения путем электропорации, трансформации растительных протопластов чужеродной ДНК в присутствии полиэтиленгликоля, микроинъекцией ДНК, биологической бомбардировкой золотыми или вольфрамовыми частицами, покрытыми молекулами ДНК, введением плазмидной ДНК с помощью игольчатых кристаллов карбида или нитрида кремния и др.

Но все эти способы получения трансгенных растений так или иначе основаны на использовании селективных маркерных генов, которыми обычно служат бактериальные гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам.

Иными словами, тот фрагмент ДНК, который исследователь вводит в геном трансформируемого растения, помимо нужного гена, содержит и маркерный ген.

Эти селективные маркерные гены нужны для того, чтобы в лаборатории в процессе регенерации отделить единичные трансформированные клетки от нетрансформированных (которых большинство) и дать первым преимущество при делении.

В результате трансгенное растение, полученное из таких трансформированных клеток, становится устойчивым к определенному антибиотику (чаще всего к канамицину) или к какому-нибудь гербициду вроде глифосата. При последующем выращивании трансгенных растений в полевых условиях появляется теоретическая возможность перемещения генов резистентности к гербициду в родственные сорняки или генов резистентности к антибиотику назад в бактерии почвы. Именно здесь и заключается определенная экологическая опасность ввиду вероятности появления, в частности, так называемых суперсорняков.

Однако в целом ряде работ было показано, что такое событие крайне маловероятно. Более того, выращивание так называемых транспластомных растений (на которых остановимся чуть ниже) сводит часть этих опасений к нулю, ввиду того, что пыльца у таких растений остается не трансгенной. (8)

К тому же процессы переноса генов, хотя и с чрезвычайно низкой частотой, но происходят в самой природе с помощью бактерии Agrobacterium tumefaciens, которую даже называют «природным генным инженером», и поэтому такие измененные самой Природой растения нас уже давно окружают.

4. Повышение стабильности протопластов

Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства (прежде всего к фитопатогенным грибам и насекомым), так как болезни растений стали основным лимитирующим фактором получения урожая.

Было обнаружено, что устойчивость растений к вредителям можно запрограммировать генетически – введением в геном растений чужеродных генов, продукты которых вызывают гибель вредителя. Традиционно для этого используют ген bt, продуктом которого является бактериальный токсин, продуцируемый бактерией Bacillus thuringiensis. Этот крупный белок (протоксин), контролируемый геном bt, попадая в кишечник личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приводит к гибели насекомых. Трансгенные растения картофеля, хлопка, кукурузы с геном bt уже производятся фирмами «Monsanto», «Ciba Seeds» и успешно продаются на мировом рынке.

Известно, что растения, подобно животным, способны вырабатывать иммунитет. Однако этим замечательным свойством обладают только устойчивые растения, у которых при атаке патогенов резко меняется метаболизм. В результате у этих растений накапливаются такие химические соединения, как пероксид водорода), салициловая кислота и фитоалексины. Повышенное содержание этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами.

Например, трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилата гидролазы (этот фермент разрушает салициловую кислоту), были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки и растениях в ответ на патоген пероксида водорода может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.

Многообещающим направлением в генной инженерии растений является получение трансгенных растений, содержащих комбинацию определенных гормональных генов бактерий. Оказалось, что плоды некоторых из таких трансгенных растений являются партенокарпическими, т.е. сформировавшимися без опыления. Эти плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему «лишних косточек», например в арбузе, у цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.

Во всем мире активно ведутся работы по созданию на основе трансгенных растений так называемых «съедобных вакцин», которые в дальнейшем можно будет использовать для предупреждения наиболее опасных болезней человека. (4)

Например, учеными СО РАН успешно ведется разработка противотуберкулезной вакцины. При создании вакцины ученые используют гены человека, кодирующие синтез специфических антител к белкам возбудителя болезни – Mycobacterium tuberculosis. Эти антитела и обеспечивают иммунитет к данному заболеванию. Гены, кодирующие антитела протии туберкулеза, встроили в геном растительных клеток. Из клеток, и которых удачно произошло встраивание защитных генов, регенерировали полноценные растения, которые обладают способностью синтезировать антитела против туберкулеза. (3)

Традиционные методы лечения туберкулеза не всегда безвредны и эффективны, и ученые надеются, что использование трансгенных растений дает шанс не только избавиться от болезни, но и избежать побочных эффектов. Также в Институте физиологии и биохимии растений СО РАН создается вакцина против СПИДа гепатита на основе трансгенеза томата и огурца. Группе немецких ученых-генетиков из Giessen University во Франкфурте удалось вырастить генетически модифицированную морковь, которая содержит вакцину против гепатита В, что позволяет значительно снизить затраты на профилактику этого заболевания (по официальной статистике ВОЗ около 350 млн человек в мире инфицированы вирусом гепатита В, который приводит к тяжелым повреждениям печени, хронизации процесса и смертельным исходам, ежегодно унося 1 млн человеческих жизней).

Трансгенная морковь может расти в разных климатических поясах и на разных грунтах, хорошо хранится, транспортируется, может употребляться в сыром виде. Потребляя этот продукт с пищей, человек как бы постоянно вводит вакцину маленькими дозами, чем поддерживает активность иммунитета к вирусу гепатита В.

Заключение

Крупнейшим в мире производителем и потребителем трансгенных растений являются США, лидирующие как по площадям посевов, так и по степени принятия обществом трансгенной пищи.

Повсеместное использование там генетически модифицированных растений (от общего количества, взятого за 100%) составляет: 40% выращиваемой в стране кукурузы, 81% сои, 65% канолы (рапса) и 73% хлопка, и оно продолжает расти. Получением и испытанием таких растений занимаются сотни коммерческих фирм с совокупным капиталом более 100 млрд долл.

На сегодня лидером по выращиванию трансгенного хлопка, устойчивого к насекомым, является Китай. В Аргентине, правительство которой поддерживает выращивание генетически модифицированных культур, доля трансгенной сои составляет 90%, а кукурузы и хлопка – 50%.

Южно-Африканская Республика – единственная африканская страна с масштабными посадками трансгенных культур – 80% хлопка, 20% кукурузы и 11% сои здесь генетически модифицированы. Остальную часть Африки агробиотехнологические фирмы рассматривают прежде всего как полигон будущих испытаний.

Япония одним из приоритетов своего научного бюджета сделала агробиотехнологию, несмотря на то, что применение генетически модифицированных продуктов встречает здесь сильное сопротивление общественности.

В Европе после принятия ЕС в 1998 г. правил применения генетически модифицированной продукции Франция, Италия, Дания, Греция и Люксембург запретили эти продукты. Сейчас ЕС принял новые правила сертификации и маркировки последних и значительно смягчил свою позицию. Однако только в Испании в незначительных объемах выращивают трансгенную кукурузу.

В России к выращиванию на полях не разрешено ни одно трансгенное растение.

Исключение составляет трансгенная соя, и то только в качестве пищевого сырья или компонента продуктов (ее можно есть, но не выращивать).

Несмотря на потрясающие успехи биотехнологии по созданию трансгенных растений с одновременным проведением всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность, в обществе существует настороженное отношение к генетически модифицированным продуктам. Есть вполне реальные опасения по поводу того, что пыльца и семена трансгенных растений и сорняков могут скреститься и в конечном счете вырастет такой суперсорняк, который не сможет уничтожить ни один гербицид. (4)

Вместе с тем неконтролируемое распространение («горизонтальный перенос») чужеродных генов в популяции культурных, традиционных сортов и дикорастущих форм растений может привести к нарушению равновесия в биоценозах, а также к засорению традиционных сортов трансгенными вставками и в дальнейшем к их полному уничтожению.

Улучшение питательных свойств картофеля, кукурузы, сои может стать причиной тяжелых аллергических реакций у человека. Некоторые ученые высказывают серьезную обеспокоенность по поводу возможности образования новых вирулентных штаммов в результате генетической рекомбинации между трансгенами и генами природных вирусов.

Список литературы

1. www.mediana-eco.ru

2. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. М., Мир, 1989.

3. Биотехнология растений. Под ред. С. X. Мантелла и X. Смита. М., ВО Агропромиздат, 1987.

4. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. – М.: Мир, 1991. – 408 с.

5. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988.

6. Николаев В. Биотехнология – приоритетное направление // Фармацевтический вестник. http://www.pharmvestnik.ru/cgi-bin/statya.pl? sid=3782.

7. Сазыкин Ю.О. Биотехнология: учебное пособие для студентов высш. учеб. заведений / Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева; под ред. А.В. Катлинского. – 3-е изд., стер. – М.: Издательский центр «Академия», 2008.

8. Современная генетика / под ред. Ф. Айала, Д. Кайчур. – М.: Мир, 1987.