Методы физиологических исследований

МЕТОДЫ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Физиология – наука, изучающая механизмы функционирования организма в его взаимосвязи с окружающей средой (эта наука о жизнедеятельности организма), физиология – наука экспериментальная и основными методами физиологической науки являются экспериментальные методы. Однако физиология как наука зародилась внутри медицинской науки еще до нашей эры в Древней Греции в школе Гиппократа, когда основным методом исследования был метод наблюдения. Выделилась физиология в самостоятельную науку в XV веке благодаря исследованиям Гарвея и ряда других ученых естествоиспытателей, и, начиная с конца XV – начала XVI веков, основным методом в области физиологии являлся метод эксперимента. И.Н. Сеченовым и И.П. Павловым был внесен значительный вклад в развитие методологии в области физиологии, в частности в разработке хронического эксперимента.

Литература:

1. Физиология человека. Косицкий

2. Корбков. Нормальная физиология.

3. Зимкин. Физиология человека.

4. Физиология человека под ред. Покровского В.Н., 1998 г.

5. Физиология ВНД. Коган.

6. Физиология человека и животных. Коган. 2 т.

7. Под ред. Ткаченко П.И. Физиология человека. 3 т.

8. Под ред. Ноздрочева. Физиология. Общий курс. 2 т.

9. Под ред. Кураева. 3 т. Переводной учебник ? физиологии человека.

Метод наблюдения – самый древний, зародился в Др. Греции, хорошо развит был в Египте, на Др. Востоке, в Тибете, в Китае. Суть этого метода заключается в длительном наблюдении изменений функций и состояний организма, фиксирование этих наблюдений и по возможности сопоставление визуальных наблюдений с изменениями организма после вскрытия. В Египте при мумифицировании трупы вскрывались, наблюдения жреца за больным: изменения кожных покровов, глубина и частота дыхания, характер и интенсивность выделений из носа, ротовой полости, а также объем и цвет мочи, ее прозрачность, количество и характер выделяемого кала, его цвет, частота пульса и другие показатели, которые сопоставлялись с изменениями во внутренних органах, фиксировались на папирусе. Таким образом уже по изменению выделяемых организмом кала, мочи, мокроты и т.д. можно было судить о нарушении функций того или иного органа, например, если кал белого цвета допустимо предполагать нарушение функций печени, если кал черного или темного цвета, то возможно предположить желудочного или кишечное кровотечение. Дополнительным критерием служили изменения цвета и тургора кожи, отечность кожи, ее характер, окраска склера, потливость, дрожь и т.д.

Гиппократ к наблюдаемым признакам относил характер поведения. Благодаря своим тщательным наблюдениям им было сформулировано учение о темпераменте, согласно которому все человечество по особенностям поведения делится на 4 типа: холерики, сангвиники, флегматики, меланхолики, однако Гиппократ ошибся в физиологическом обосновании типов. В основу каждого типа им было положено соотношение основных жидкостей организма: сангви – кровь, флегма – тканевая жидкость, холеа – желчь, меланхолеа – черная желчь. Научное теоретическое обоснование темпераментов было дано Павловым в результате длительных экспериментальных исследований и оказалось, что в основе темперамента лежит не соотношение жидкостей, а соотношение нервных процессов возбуждения и торможения, степень их выраженности и преобладание одного процесса над другим, а также скорость смены одного процесса другими.

Метод наблюдения широко используется в физиологии (особенно в психофизиологии) и в настоящее время метод наблюдения сочетается с методом хронического эксперимента.

Метод эксперимента. Физиологический эксперимент в отличие от простого наблюдения – это целенаправленное вмешательство в текущее отправление организма, рассчитанное на выяснение природы и свойств его функций, их взаимосвязей с другими функциями и с факторами внешней среды. Также вмешательство часто требует хирургической подготовки животного, которое может носить: 1) острую (вивисекционную, от слова vivo – живое, sekcia – секу, т.е. секу по живому), 2) хроническую (экспериментально-хирургическую) формы.

В связи с этим эксперимент подразделяют на 2 вида: острый (вивисекция) и хронический. Физиологический эксперимент позволяет ответить на вопросы: что происходит в организме и как происходит.

Вивисекция представляет собой форму эксперимента, проводимую на обездвиженном животном. Впервые вивисекция начала применятся в средние века, но широко стала внедряться в физиологическую науку в эпоху Возрождения (XV-XVII в). Наркоз в то время не был известен и животное жестко фиксировалось за 4 конечности, при этом оно испытывало мучения и издавало душераздирающие крики. Эксперименты проводились в в специальных комнатах, которые народ окрестил «дьявольскими». Это послужило причиной появления философских групп и течений. Анимализм (течения, пропагандирование гуманного отношения к животным и выступление за прекращение издевательств над животными, анимализм пропагандируется в настоящее время), витализм (ратовало за то, не проводились эксперименты на ненаркотизированных животных и волонтерах), механицизм (отожествляли правильно протекающие в животном с процессами в неживой природе, ярким представителем механицизма был французский физик, механик и физиолог Рене Декарт), антропоцентризм.

Начиная с XIX века в остром эксперимента стали применять наркоз. Это привело к нарушению процессов регуляции со стороны высших отростков ЦНС, в результате нарушается целостность реагирования организма и его связь с внешней средой. Такое применение наркоза и хирургическая травля при вивисекции вносит в острый эксперимент неконтролируемые параметры, которые трудно учесть и предвидеть. Острый эксперимент, как и любой экспериментальный метод, имеет свои достоинства: 1) вивисекция – один из аналитических методов, дает возможность моделировать разные ситуации, 2) вивисекция дает возможность получать результаты в относительно короткий срок; и недостатки: 1) в остром эксперименте отключается сознание при применении наркоза и соответственно нарушается целостность реагирования организма, 2) нарушается связь организма с окружающей средой в случаи применения наркоза, 3) при отсутствии наркоза идет неадекватный нормальному физиологическому состоянию выброс стрессорных гормонов и эндогенных (вырабатываемых внутри организма) морфиноподобных веществ эндорфинов, оказывающих обезболивающий эффект.

Все это способствовало разработке хронического эксперимента – длительного наблюдения после острого вмешательства и восстановление взаимоотношений с окружающей средой. Преимущества хронического эксперимента: организм максимально приближен к условиям интенсивного существования. Некоторые физиологи к недостаткам хронического эксперимента относят то, что результаты получаются в относительно длительный срок.

Хронический эксперимент впервые был разработан отечественным физиологом И.П. Павловым, и, начиная с конца XVIII века, широко применяется в физиологических исследованиях. В хроническом эксперименте используется ряд методических приемов и подходов.

Метод, разработанный Павловым – метод наложения фистул на полые органы и на органы, имеющие выводные протоки. Родоначальником фистульного методы был Басов, однако при наложении фистулы его методом, содержимое желудка попадало в пробирку вместе с пищеварительными соками, что затруднило изучение состава желудочного сока, этапов пищеварения, скорости протекания процессов пищеварения и качества отделяемого желудочного сока на различный состав пищи.

Фистулы могут накладываться на желудок, протоки слюнных желез, кишечник, пищевод и др. Отличие павловской фистулы от басовской состоит в том, что Павлов накладывал фистулу на «малый желудочек», сделанный искусственно хирургическим путем и сохраняющий пищеварительную и гуморальную регуляцию. Это позволило Павлову выявить не только качественный и количественный состав желудочного сока на принимаемую пищу, но и механизмы нервной и гуморальной регуляции пищеварения в желудке. Кроме того, это позволило Павлову выявить 3 этапа пищеварения:

1) условнорефлекторный – при нем выделяется аппетитный или «запальный» желудочный сок;

2) безусловнорефлекторная фаза – желудочный сок выделяется на поступившую пищу независимо от ее качественного состава, т.к. в желудке располагаются не только хеморецепторы, но и нехеморецепторы, реагирующие на объем пищи,

3) кишечная фаза – после того как пища попадает в кишечник, то пищеварение усиливается.

За свои работы в области пищеварения Павлов был удостоен Нобелевской премии.

Гетерогенные нервно-сосудистые или нервно-мышечные анастенозы. Это изменение эффекторного органа в генетически детерминированной нервной регуляции функций. Проведение таких анастеноз позволяет выявить отсутствие или наличие пластичности нейронов или нервных центров в регуляции функций, т.е. может ли седалищный нерв с остатком позвоночника управлять дыхательной мускулатурой.

При нервно-сосудистых анастенозах эффекторними органами являются кровеносные сосуды и соответственно расположенные в них хемо- и барорецепторы. Анастенозы могут выполняться не только на одном животном, но и на разных животных. Например, если сделать анастеноз нервно-сосудистый у двух собак на каротидную зону (разветвление дуги сонной артерии), то можно выявить участи различных отделов ЦНС в регуляции дыхания, кроветворения, сосудистого тонуса. При этом режим вдыхаемого воздуха изменяют у донной собаки, а регуляцию видят у другой.

Пересадка различных органов. Подсадка и удаление органов или различных участков мозга (экстирпация). В результате удаления органа создают гипофункцию той или иной железы, в результате подсадки создают ситуацию гиперфункции или избытка гормонов той или иной железы.

Экстирпация различных участков головного мозга и коры головного мозга выявляют функции этих отделов. Например, при удалении мозжечка было выявлено его участи в регуляции движения, в поддержании позы, статокинетических рефлексов.

Удаление различных участков коры головного мозга позволило Бродману картировать мозг. Он разделил кору на 52 поля по функциональным отправлениям.

Метод перерезки головного спинного мозга. Позволяет выявить функциональную значимость каждого отдела ЦНС в регуляции соматических и висцеральных функций организма, а также в регуляции поведения.

Вживление электронов в различные участки мозга. Позволяет выявить активность и функциональную значимость той или иной нервной структуры в регуляции функций организма (двигательных функций, висцеральных функций и психических). Электроды, вживляемые в мозг, делаются из инертных материалов (т.е. они должны быть интоксичными): платина, серебро, палладий. Электроды позволяют не только выявлять функцию того или иного участка, но и наоборот, зарегистрировать в каком участке мозга появление вызывает потенциал (ВТ) в ответ на те или иные функциональные отправления. Микроэлектродная техника дает человеку возможность изучить физиологические основы психики и поведения.

Вживление канюль (микро). Перфузия – пропускание растворов различного химического состава по нашему компоненту или по наличию в нем метаболитов (глюкоза, ПВК, молочная кислота) или по содержанию биологически активных веществ (гормоны, нейрогормоны, эндорфины, энкефамины и др.). Канюль позволяет вводить растворы с разным содержимым в ту или иную область мозга и наблюдать изменение функциональной активности со стороны двигательного аппарата, внутренних органов или поведения, психологической деятельности.

Микроэлектродная технология и конюлирование применяются не только на животных, но и на человеке во время хирургических операций на мозге. В большинстве случаев это делается с диагностической целью.

Введение меченых атомов и последующее наблюдение на позитронно-эмиссионном томографе (ПЭТ). Чаще всего вводят ауро-глюкозу, меченную золотом (золото+глюкоза). По образному выражению Грине, универсальным донором энергии во всех живых системах является АТФ, а при синтезе и ресинтизе АТФ основным энергетическим субстратом является глюкоза (ресинтез АТФ может так же происходить из креатин-фосфата). Поэтому по количеству потребляемой глюкозы судят о функциональной активности того или иного участка мозга, о его синтетической активности.

Глюкоза потребляется клетками, а золото не утилизируется и накапливается в этом участке. По разноактивному золоту, его количеству судят о синтетической и функциональной активности.

Стереотаксические методы. Это методы, при которых проводятся хирургические операции по вживлению электродов в определенной области мозга в соответствии со стереотаксическим атласом мозга с последующей регистрацией отведенных быстрых и медленных биопотенциалов, с регистрацией вызванных потенциалов, а также регистрацией ЭЭГ, миограммы.

При постановке новых целей и задач одно и тоже животное можно использовать в течение длительного времени наблюдения, изменения расположения микроэлементов или перфузируя различные области мозга или органы различными растворами, содержащими не только биологически активные вещества, но и метатолиты, энергетические субстраты (глюкоза, креотинфосфат, АТФ).

Биохимические методы. Это большая группа методик, с помощью которых в циркулирующих жидкостях, тканях, а иногда и органах, определяют уровень катионов, анионов, неноницированных элементов (макро и микроэлементов), энергетических веществ, ферментов, биологически активных веществ (гормоны и др.). Эти методы применяются как in vivo (в инкубаторах) или в тканях, которые продолжают секретировать и синтезировать вырабатываемые вещества в инкубационную среду.

Биохимические методы позволяют оценивать функциональную активность того или иного органа или его части, а иногда и целой системы органов. Например, по уровню 11-ОКС можно судить о функциональной активности пучковой зоны коры надпочечников, но по уровню 11-ОКС можно судить и о функциональной активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. В целом, поскольку 11-ОКС является конечным продуктом периферического звена коры надпочечников.

Методы изучения физиологии ВНД. Психическая работа мозга долго оставалась недоступной для естествознания в целом и для физиологии в частности. Главным образом потому, что о ней судили по ощущениям и впечатлениям, т.е. с помощью субъективных методов. Успех в этой области знаний определился тогда, когда о психической деятельности (ВНД) стали судить с помощью объективного метода условных рефлексов разной сложности выработки. В начале XX века Павловым была разработана и предложена методика выработки условных рефлексов. На основе этой методики возможны дополнительные приемы изучения свойств ВНД и локализации процессов ВНД в головном мозге. Из всех приемов наиболее часто используются следующие приемы:

Пробы возможности образования разных форм условных рефлексов (на высоту тона звука, на цвет и т.д.), что позволяет судить о условиях первичного восприятия. Сопоставления этих границ у животных разных видов позволяет выявить: в каком направлении шла эволюция сенсорных систем ВНД.

Онтогенетическое изучение условных рефлексов. Сложное поведение животных разных возрастов при его изучении позволяет установить, что в этом поведении является врожденным, а что приобретенным. Например, Павлов брал щенков одного помета и вскармливал одних мясом, а других молоком. По достижению зрелого возраста вырабатывал у них условные рефлексы, и оказалось, что у тех собак, которые с детства получали молоко, условные рефлексы вырабатывались на молоко, а у тех собак, которых с детства кормили мясом, условные рефлексы легко вырабатывались на мясо. Таким образом, строгого предпочтения виду плотоядной пищи у собак нет, главное, что бы она была полноценной.

Филогенетическое изучение условных рефлексов. Сравнивая свойства условнорефлекторной деятельности животных разного уровня развития, можно судить: в каком направлении идет эволюция ВНД. Например, оказалось, что скорость образования условных рефлексов резко от беспозвоночных и позвоночных, сравнительно мелко изменяется на протяжении всей истории развития позвоночных и скачком достигает способностей человека сразу связывать ?, совпавшие события (импринтинг), импринтинг также свойственен выводковым птицам (вылупившиеся из яйца утята могут следовать за любым предметом: курица, человек и даже за движущейся игрушкой. В переходах беспозвоночные животные – позвоночные животные, позвоночные животные – человек отразились переломные этапы эволюции, связанные с возникновением и развитием ВНД (у насекомых нервная система неклеточного типа, у кишечнополостных – ретикулярного типа, у позвоночных – трубчатого типа, у птиц появляются бальные ганглии, некоторые обуславливают высокое развитие условнорефлекторной деятельности. У человека хорошо развита кора больших полушарий, что и обуславливает скачек.

Экологическое изучение условных рефлексов. Потенциал действия, возникающий в нервных клетках, участвующих в образовании рефлекторных связей, позволяет выявить основные звенья условного рефлекса.

Особенно важно то, что биоэлектронные показатели дают возможность наблюдать формирование условного рефлекса в структурах мозга еще до того, как он появится в двигательных или вегетативных (висцеральных) рефлексах организма. Прямое раздражение нервных структур мозга позволяет ставить модельные опыты по образованию нервных связей между искусственными очагами возбуждения. Можно также прямо определять, как изменяется при условном рефлексе возбудимость участвующих в нем нервных структур.

Фармакологическое действие при формировании или переделке условных рефлексов. Вводя в мозг определенные вещества можно определить, какое влияние они имеют на скорость и прочность образования условных рефлексов, на способность к переделке условного рефлекса, что позволяет судить о функциональной подвижности ЦНС, а также на функциональное состояние нейронов коры и их работоспособность. Например, было выявлено, что кофеин обеспечивает образование условных рефлексов при высокой работоспособности нервных клеток, а при низкой их работоспособности даже небольшая доза кофеина делает возбуждение непосильным для нервных клеток.

Создание экспериментальной патологии условно-рефлекторной деятельности. Например, хирургическое удаление височных долей коры больших полушарий ведет к псической глухоте. Методом экстирпации выявляется функциональная значимость участков коры, подкорки и стволовых отделов мозга. Таким же образом определяют локализацию корковых концов анализаторов.

Моделирование процессов условно-рефлекторной деятельности. Еще Павлов привлекал математиков для того, чтобы выразить формулой количественную зависимость образования условного рефлекса от частоты его подкрепления. Оказалось, что большинства здоровых животных, включая человека, условный рефлекс вырабатывался у здоровых людей после 5 подкреплений безусловным раздражителем. Особенно это важно в служебном собаководстве и в цирке.

Сопоставление психологических и физиологических проявлений условного рефлекса. Поддержка произвольного внимания, полета, эффективность обучения.

Сопоставление психологических и физиологических проявлений с биоэлементами и морфологическими с биокинетическими: выработка белков памяти (S-100) или участков биологически активных веществ в формировании условных рефлексов. Доказано, что если ввести вазопроессии, то условные рефлексы вырабатываются быстрее (вазопрессии – нейро-гормон, вырабатываемый в гипоталамусе). Морфологические изменения структуры нейрона: голый нейрон при рождении и с денуритами у взрослого человека.

Лабораторное занятие №1

Тема: Методы экстирпации и подсадки

Цель: Знакомство с методами экстирпации и подсадки паращитовидных желез. Моделирование гипо- и гипрепаратиреоза.

Оборудование: лабораторные животные (5 крыс), электрокоагулятор, пинцет, ножницы, скальпель, йод, иглы для зашивания кожи, шовный материал, операционный столик, эфир для наркоза, воронка.

Ход работы

Работа 1. Моделирование дефицита паратиреоидных гормонов у крыс.

Дефицит паратгормонов создается удалением обеих паращитовидных желез при помощи аппарата эклетрохирургичесоко высокочастотного ЭХ-30. Принцип работы прибора заключается в следующем: за счет тока высокой частоты происходит быстрое нагревание тканей и испарение содержимого клеток. Аппарат работает в 2 режимах: «резание» и «коагуляция». Удаление желез происходит в режиме коагуляцией тонким электродом d примерно равен размерам ОЩЖ. Для коагуляции желез достаточно соприкосновение в течение 1-1,5 с. В режиме резания железы можно экстилировать. Преимущества коагуляции по сравнению с экстилацией ОЩЖ заключается в том, что исключается кровопотеря и не повреждается ткань щитовидной железы. Послеоперационный период 2 недели.

Работа 2. Моделирование избытка паратиреоидных гормонов у крыс.

Для моделирования гиперпаратиреоза использовали метод трансплантации ОЩЖ. Сущность метода заключается в трансплантации крысам-реципиентам под кожу шеи 3-х пар ОЩЖ от 3-х крыс доноров. Крысы-доноры должны быть примерно одного веса с крысой-реципиентом.

Донорам под эфирным наркозом делают разрез кожи в области передней плотности шеи длиной 2-3 см, следовательно тупым способом раздвигают мышцы, делаю доступными ОЩЖ. В этом состоянии крысу-донора помещают под воронку, продолжая давать эфирный наркоз. Животное-реципиента перед операцией фиксировали на спинке на хирургическом столике, также как и у крыс-доноров производили разрез кожи длиной 2-3 см в области передней плотности шеи. Затем ? скальпелем делали в подкожной клетчатке 6 неглубоких надрезов, которые служили своего рода ячейками для трансплантируемых ОЩЖ. Затем у 3-х крыс-доноров быстро отсекали ОЩЖ и помещали их в подготовленные разрезы у крысы-реципиента. Разрез кожи репициента зашивали хирургическим шелком и обрабатывали йодом. В последующие дни производили ревизию операционной раны. Полное заживление раны наблюдалось через 7-8 дней. Трансплантационные ОЩЖ хорошо приживаются. Данная модель убытка парат. гормонов позволяет обеспечить круглосуточное увеличение его в крови за счет естественного парат. гормона.

Задание для самостоятельной работы.

Пронаблюдать за состоянием оперированных животных вплоть до полного заживления раны и повторного их взятия в эксперимент.

Спустя 2 недели определить у оперированных животных уровень общего кальция, косвенно свидетельствующего о функциональной активности ОЩЖ и с-клеток щитовидной железы, а также уровня 11-ОКС, изменяющейся как в ответ на стрессорное хирургического воздействие, так и в ответ на нарушение функции ОЩЖ (точнее на нарушение гомеостаза кальция).

Лабораторное занятие №2

Работа 1. Двусторонняя овариоэктомия.

Для изучения электрогенов в адаптационно-приспособительной деятельности организма, самок крыс подвергали двусторонней овариоэктомии. Операция выполняется в соответствии с рекомендациями, изложенного в руководстве Бунока, 1968.

Животных наркотизировали эфиром и фиксировали на операционном столе в положении на спине. Шерсть на брюшке от грудины до лобковой области выстригали и кожу обработали спиртом. Скальпелем, осторожно, чтобы не повредить кишечник делали продольный разрез длиной 4-5 см по вредней линии живота. Найдя правый или левый рог матки, исследуя далее по нему по яйцеводу, находим яичник. Накалываем лигатуру на верхнюю часть яйцевода и связку, поддерживающую яичник, после чело обрезали его ножницами. Аналогично удалили и второй яичник. После этого мышцы и конец ушивали и шов обрабатывали 5% йодной настойкой.

После операции животных помещали в чистую клетку, в течение первых 4-5 дней проводили ежедневную обработку раны дезинфицирующими средствами. Заживление раны происходило за 8-10 дней.

Работа 1. Односторонняя адреналэктомия.

Для моделирования дефицита эндогенных глюкокортикоидов животных подвергании АЭ (адреналэктомии).

Оперативное удаление одного надпочечника производили по метотдике, представленной в руководстве Кабак Я.М. Операцию проводили под эфирным наркозом. Крысу фиксировали на операционном столе в положении на животе. Слева от позвоночника выстригали шерсть и обрабатывали операционное поле йодом. Разрез кожи и мышцы производили на расстоянии 1 см. слева от позвоночника, отступая на 1,5 см. книзу от реберной дуги. Далее небольшой мышечный разрез расширяли крючками. Надпочечник вместе с окружающей его жировой тканью и соединительнотканным тяжом захватывали анатомическим пинцетом и удаляли. Операционную рану послойно ушивали.

В послеоперационный период каждую рану ежедневно обрабатывали антисептическими средствами. Заживление происходило через 5-7 дней.

Вывод: Оварио- и адреналэктомия одновременно привели к резкому снижению адаптивных возможностей животных в связи с нарушениями гормнального баланса (гипофункция надпочечников привела к гипокартицизму и гипоэстрагении) и его гибели на 9 сутки после операции.

Лабораторное занятие №3

Тема: Методы введения фармацевтических препаратов лабораторным животным . Тестирующие методы.

Цель: Ознакомиться с методическими приемами и способами введения фармацевтических препаратов и различного рода пероральных и парэнтеральных нагрузок лабораторным животным.

Оборудование: шприцы для перорального, внутримышечного и перэнтерального введения, лекарственные вещества или водной нагрузки, 2 воронки с колпаками, 2 пробирки для сбора мочи (мирные), 2 пеленки, раствор петуитрина (содержит антидиуретический гормон – вадопресин), физиологический раствор, дистиллированная вода.

Ход работы

Работа 1. Влияние водной и гиперсоматической нагрузки на диурез. Влияние антидиуретического гормона на диурез.

Крыс взвесить и записать массу тела. Затем дать крысам водную нагрузку методом перорального введения. Для этого крысу подвесить в штатив «мягко», запеленать, в шприц, соединенный с зондом, набрать теплую воду (37^оС) из расчета 5% от массы тела. Держа крысу вертикально вводят зонд в рот, и осторожно продвигают его в желудок до упора, после чего постепенно выдавливают из шприца воду. Затем одной крысе вводят петуитрин из расчета 20 мл на 100 г. массы тела. После этого обеих крыс помещают в воронки и в течение 1 часа собирают мочу. Петуитрин вводится внутримышечно. С этой целью корцнгом берут за кожу головы и держат одной рукой одновременно и корцанг, и хвост крысы, стараясь, чтобы крыса касалась всеми 4 лапами поверхности стола и ее размеры соответствовали физиологическим размерам. Второй рукой производится инъекция в бедро (мышцы) при этом задняя лапка удерживается вместе с хвостом.

Вывод: Без петуитрина: 1,2 мл, с петуитрином 0,7 мл, т.е. петуитрин способствует задержке воды в организме.

Метод парентерального введения. Используется, когда введенные вещества должны как можно быстрее попасть в общий кровоток, и в том случае, когда объем вводимых препаратов превышает дозы, допустимые для внутримышечного введения. При парентеральном способе введения объем может достигать 5 см³. Парентерально предпочтительнее вводить масленые растворы лекарственных веществ.

При парентеральном способе введения животное держат вниз головой, нельзя позволять животному резко двигаться в согнутом положении. С этой целью животное корцангом фиксируют за голову, а руками за хвост. С помощью анатомического пинцета или небольшого зажима Кохера оттягивают стенку брюшной полости, при этом органы брюшной полости опускаются вниз, затем делаю прокол брюшной стенки, фиксирую 2 прокола: 1 через кожу, 2 через мышечную стенку брюшины. После этого лекарство вводиться в брюшную полость. Свидетельством правильного введения лекарственного препарата в брюшную полость является отсутствие осложнений в области брюшной полости и активное состояние животного после инъекции при условии введения не наркотических веществ. При одном проколе введение будет подкожные.

Лабораторное занятие №4

Тема: Методы биологического тестирования.

Цель: Ознакомиться с методами биологического тестирования функциональной активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы.

Оборудование: гипофиз крысы-реципиента, гипоталамус крысы-реципиента, крыса-донор, реактивы, необходимые для приготовления экстракта гипофиза и гипоталамуса, корнцанг, зажим Кохера, шприц для внутривенного введения, ножницы, гепарин, пробирки для сбора крови, штатив, торсионные весы, водная баня, термометр, эфир для наркоза.

Ход работы

Работа 1. Определение содержания кортикотропина в гипофизе.

Перспективность метода заключается в определении прироста объема 11-ОКС в плазме крови крыс-реципиентов. После введения им тестируемых экстрактов гипофиза. Для определения содержания кортикотрпина предварительно строится колебательная кривая.

Техника определения: гипофиз взвешивали на торзионных весах и помещали в бокс с безводным ацетоном на 10 суток. Затем гипофиз взвешивали и тщательно растирали в 100 млк ледяной уксусной кислоты. Палочку ополаскивали таким же количеством уксусной кислоты. После этого чашечку помещали на водяную баню и выпаривали при t 70^оС в течение 30 минут. Полученный экстракт разводили в 2 мл бидистиллята и нейтрализировали 1 молярным NaHCO₃, затем разбавляли до нужной массы раствором Кребса-Рингера, содержащим бикарбонат и глюкозу. При разведении гипофизарных экстрактов учитывали, что одной крысе-реципиенту надо ввести 100 мкг ацетонированного порошка.

Биологическое тестирование с целью определения содерджания кортикотропина в гипофизе предпочтительно проводить на крысах самцах. В сутки до опыта крысам подкожно вводили преднизаон из расчета 6 мг на 100 г массы тела. Указанная доза кортикостероида по принципу обратной связи блокирует гипофизарно-надпочечниковую систему крыс-реципиентов, прекращая эндогенную секрецию кортикотропина. Через сутки у крыс определяется уровень 11-ОКС в плазме крови. Необходимое количество гипофизарного экстракта вводили внутривенно и через 1 час повторно определяли уровень 11-ОКС после введения крысам-реципиентам тестируемых экстрактов гипофиза. Пользуясь кривой «логарифм доул-эффект» устанавливали содержание кортикотропина в гипофизе опытной крысы в мед/ 100 мгм ткань.

Лабораторное занятие №5

Тема: Биохимические методы в физиологии.

Занятие 1. Определение 11-ОКС в плазме крови.

Цель: определить изменение объема 11-ОКС в плазме крови после воздействия оперативного вмешательства физиологического эксперимента.

Методика: 1. У животного взять 1-1,5 мл крови (из хвостовой вены или бедренной вены);

2. Кровь отцентрифугировать в течение 10 мин при 2000 об/мин;

3. Отделить плазму от форменных элементов и перенести ее в пробирку с притертой пробкой. Плазмы должно быть 1 мл или довести до этого количества бидистиллятом.

4. В пробирку добавить 6 мл гексана, встряхивать в течение 20 с. При этом у плазмы удаляется холестерин. Удалить отработанный гексан с помощью водоструйного насоса.

5. Добавить хлороформа 10 мл, встряхивать в течение 1 мин. При этом кортикостероиды растворяются в хлороформе. Оставшуюся фракцию плазмы удалить насосом.

6. Экстракт промыть 0,1 М раствором NaOH, добавляя по 1 мл. Встряхиваем 1 мин и удаляем водоструйным насосом.

7. 1 мл воды бидистиллируем, а дальше встряхиваем 1 мин и удаляем водоструйным насосом.

8. После отобрать 8 мл экстракта и перенести в чистую сухую пробирку с притертой пробкой.

9. В экстракт добавить 6 мл смеси абсолютного спирта (этилового) с H₂SO₄, которая выдерживает пробу во Савамо. Соотношение спирта и кислоты 1:3 (3 спирта и 1 кислоты). Встряхивают в течение 1 мин и оставляют на холоде в теплом месте в течение часа. При этом в смеси кислоты со спиртом растворяются кортикостероиды. После этого определяется объем 11-ОКС с помощью спектрофотометра «Квант».

Оборудование: двойной набор пробирок с притертой пробкой, штативы, центрифужные пробирки, водоструйный насос, 3 ппипетки по 1 мл, 2 пипетки на 10 мл, 1 пипетка на 6 мл.

Реактивы: бидистиллят, гексан, 0,1 раствор NaOH, хророформ, 100% этиловый спирт, H₂SO₄ по Савамо (100%).

Методы исследования эмоционального статуса у крыс

1. Тест открытого поля

Латентный период выхода из центрального квадрата, число пересеченных линий, вертикальных стоек, обследованных отверстий, умываний, дефекаций. По продолжительности латентного периода выхода из центрального квадрата и числу пересеченных линий судили о двигательной активности, по количеству вертикальных стоек и обследованных отверстий – об исследовательской деятельности, число умываний говорит об эмоциональном состоянии, а по количеству дефекаций судили о тревожности.

2. Многопараметрический метод определения тревожно-фобического статуса крыс

Цель: оценить комплексную характеристику индивидуального тревожно-фобического уровня животного.

Методика: исследование проводят в открытом поле при электрическом освещении 3000 люкс в фиксированное время.

Тест 1. Латентный период спуска с высоты. Данный тест используется для оценки интенсивного оборонительного поведения у крыс. Крысы помещаются на пенал из непрозрачного материала размером 20х14х14 см и отмечается время спуска с пенала, когда крыса коснется всеми 4 лапами поля.

Тест 2. Латентный период прохождения через отверстие. Крыса помещается в прозрачный пенал, разделенный поперек на 2 отсека с отверстием 7х10 см в перегородке. Действие считается выполненным, когда крыса перелезает во 2 отсек двумя лапами. При наличии колебаний при выполнении действия, заглядывания в отверстие или начатый, но не завершенный перенос оценки на 0,5 балле.

Тест 3. Время выхода из домика. Животное помещается в домик из прозрачного плексигласа 16х15х12 см и выход на 15 мин закрывается заслонкой. Отчет времени начинается с момента открытия выхода. В тестах 1-3 крысу из экспериментальной обстановки возвращали не ранее, чем через 20 мин после выполнения соответствующего действия или по истечению времени тестирования (180 с) в случае невыполнения действия. Интервалы между тестами не менее 15 мин.

Тест 4. Выход из центра открытого поля. Этот тест позволяет выявить реакции страха, связанные со снижением двигательной активности. Тестирование начинали с помещения крысы в центр поля и с этого момента фиксировали время, за которое животное посещало 4 центральных квадрата.

По тестам 1-4 оценки выставлялись в соответствии со шкалой:

Тест 5. Пячение. Оценка функционирования реакции пячения спонтанно и при резкой смене освещенности в обстановке открытого поля. Через 180 с после момента помещения животного в поле освещенности резко меняли: выключали яркий свет и включали простую лампу на 60 с, затем восстанавливали освещенность. За 300 с наблюдения определяли измеренное расстояние в квадратах, на которое пятилось животное. Отсутствие изменений 0 баллов, на полквадрата – 1 б, до 2 квадрата – 2 б, более 2 квадратов – 3 б.

Тест 6. Пячение-2. Попытка экспериментатора взять животное на руки. Оценивается также.

Тест 7. Реакция вокализации.

Тест 8. Реакция затаивания. Животное замирает в напряженной позе