ЗНАКОМСТВО С МИКРОФЛОРОЙ ПОЧВЫ

Цель работы:выполнить анализ микрофлоры воды и почвы, вы­росшей в чашках Петри и посеянной по методу разбавления.

Оборудование:чашки Петри с посева­ми микрофлоры на среде МПА, дистиллированная вода, предметные стекла, спиртовки, микроскопы, лампы, кра­сители: генцианвиолет, раствор люголя, спирт, карболо­вый фуксин.

Ход работы:

Посев микрофлоры почвы методом разбавления

Суспензию почвы готовят следующим образом: 5 г иссле­дуемой почвы заливают в колбе 50 мл дистиллированной воды, тщательно размешивают, затем дают взвеси отстояться 5 мин. 1 мл из отстоявшейся суспензии почвы (или 1 мл ис­следуемой воды) помещают в колбу на 100 мл с 99 мл дистил­лированной воды, получая первое разбавление до 0,01, в 100 раз. Содержимое колбы взбалтывают, стерильной пипеткой отбирают 1 мл воды и переливают в пробирку с 9 мл стериль­ной воды – получают разбавление до 0,001. Отбирая из про­бирки по 1 мл жидкости и перенося ее в пробирку с 9 мл стерильной воды, получаем разбавление до 0,0001 и т. д. При разбавлении каждый раз пользуются стерильной водой и по­судой (пипеткой, колбой). После тщательного взбалтывания содержимого сосудов из каждого берут 0,1–1 мл жидкости и выливают в отдельные чашки Петри на еще теплый агар-агар. Чашки этикетируют, отмечая степень разбавления, оставляют на неделю в термо­стате при Т = 23–25 °С.

1. Сделать общий подсчет колоний в чашке Петри и рас­считать количество микроорганизмов в 1 мл исходной по­севной воды или почвенной суспензии.

2. Описать колонии микроорганизмов, выросшие в чаш­ках Петри на МПА при посеве микрофлоры воды и суспен­зии почвы, по плану.

3. Из наиболее интересных колоний сделать мазки микро­организмов, окрасить по Граму, рассмотреть с иммерсией, за­рисовать.

Подсчитываем общее количество колоний микроорганиз­мов, выросших в чашке Петри. Из одной клетки микроорганиз­мов вырастает по одной колонии. Колонии делятся по размерам (Д – диаметру): крупные (Д = 4–6 мм), средние (Д = 2–4 мм), мелкие (Д = 1–2 мм), точечные (Д = менее 1 мм). Крупные и средние колонии просчитываются полностью. Для удобства поле чашки Петри делят на сектора, просчитывая колонии в каждом секторе и затем суммируя результат. Расчет числа мелких и точечных колоний ведут с использованием «глазка» – поля зрения в 1 см². Вырезается квадрат (3 х 3 см) из милли­метровой бумаги, в центре которого делается «глазок» – поле в 1 см². Передвигая квадрат с нижней стороны чашки Петри, в трех-пяти участках различных секторов ее дна просчиты­вается полное количество всех мелких и точечных колоний, попавших в поле зрения 1 см². Затем по всем участкам под­считывают среднее количество микроорганизмов в 1 см² и делают перерасчет на всю площадь чашки Петри.

Если А – среднее количество микроорганизмов в 1 см², то на площади чашки Петри 78,5 см² содержится «X» мелких и точечных колоний микроорганизмов: А микр. – в 1 см², X микр. – в 78,5 см²:

X = А · 78,5 / 1.

Затем полученное число мелких и точечных колоний сум­мируют с количеством средних и крупных колоний микро­организмов, подсчитанных на всей площади чашки Петри. Делаем расчет количества микробов в 10 л воздуха. По при­близительным подсчетам (Омелянский) на площади в 100 см² оседает в течение пяти минут столько микроорганизмов и спор, сколько их содержится в 10 л воздуха. Если в чашке Петри выросло всего N колоний микроорганизмов, то в 10 л воздуха содержится «X» микроорганизмов:

– на площади 78,5 см² – № колоний,

– на площади 100 см² – X колоний:

Х= N · 100 / 78,5.

Допускается, что каждая колония возникла из одной клетки или споры. Производя расчеты, выясняют различия в количе­ственном составе микрофлоры помещений, где производится посев из воздуха.

Описание колоний микробов, выросших на питательной среде, проводят по следующим показателям:

а) форма колонии – округлая, амебоидная, ризоидная;

б) оптические свойства – прозрачная, матовая, флюорес­цирующая, полупрозрачная (просвечивает), непрозрачная, блестящая;

в) цвет колонии;

г) поверхность колонии – гладкая, шероховатая, складча­тая, бугристая;

д) профиль колонии – плоский, выпуклый, кратерообраз­ный, врастающий в агар;

е) край колонии – ровный, волнистый, лопастной, ризо­идный и т. д.;

ж) структура колонии – однородная, мелко- или крупно­зернистая;

з) консистенция – маслянистая, тестообразная, вязкая, пленчатая.

Допустим, что А колоний выросло на всей площади чаш­ки Петри при посеве из разбавления 1/100 мл. Тогда X коло­ний будет содержаться в 1 мл исходной жидкости (почвенной суспензии):

А : 1/100 = X : I

Х= (А х 1)/(1/100) = А х 100 (колоний / мл).

Поскольку из каждой клетки микроорганизмов выраста­ет одна колония, то подсчитываемое количество X покажет богатство ими почвенной суспензии.

Степень богатства ими почвенной суспензии различными микроор­ганизмами соответствует определенным зонам сапробности:

а) олигосапробная, или малозагрязненная, зона содержит микроорганизмы (м-о) от 101 до 103 м-о/мл;

б) мезосапробная, или зона средней загрязненности, со­держит от 103 до 106 м-о/мл;

в) полисапробная, или сильнозагрязненная, зона содер­жит до 106 и более микроорганизмов на мл.

4. Сделать вывод, к какой зоне сапробности относится почвенная суспензия. Зарисовать окрашенные по Граму микроорганизмы, сделать вывод об их принадлежности к группе грам(+) или грам(-) микроорга­низмов.