Люминесцентный качественный и количественный анализы.

Люминесцентный анализ

Люминесцентным анализом называют метод исследования различных объектов под действием ультрафиолетового облучения, вызывающего люминесценцию этих объектов. При люминесцентном анализе наблюдают или собственное свечение исследуемых тел, или свечение люминофоров, которые вводят в эти тела. Такой анализ позволяет исследовать вещество без его разрушения и при чрезвычайно малых количествах люминесцирующих примесей. Например, содержание флуоросцеина, светящегося под действием УФ облучения зеленоватым светом, можно обнаружить, когда в 1 мл воды находится 10^–10 г этого вещества! Для люминесцентного анализа используют источники УФ излучения, не содержащие видимого света. Газоразрядные лампы в таких источниках содержат ртутные пары, спектр излучения которых лежит частично в видимой и частично в ультрафиолетовой области. Светофильтры из «черного» увиолевого стекла задерживают практически все видимое излучение и пропускают лишь ртутную линию спектра с длиной волны 370 нм.

Люминесцентный анализ – совокупность методов для определения природы и состава вещества по спектру его люминесценции.

Качественный анализ – определение наличия (или отсутствия) каких-либо веществ (молекул) по форме спектра люминесценции. При этом можно изучать структуру молекул вещества; межмолекулярное взаимодействие; химические превращения.

Количественный анализ – определение количества вещества по интенсивности спектра люминесценции (можно обнаружить массу вещества т = 10^–10 г).

По методике исследования люминесцентный анализ можно представить следующей схемой.

	Люминесцентный анализ
Макроанализ		Микроанализ		Флоуресцирующие молекулы

Макроанализ – наблюдение невооруженным глазом люминесценции объектов, облученных УФ излучением.

– Проверка качества и сортировка пищевых продуктов.

– Сортировка фармакологических средств.

– Свечение волос, чешуек, ногтей при диагностике их поражения грибком и лишаем.

Микроанализ – исследование люминесцирующих микрообъектов при помощи специальных люминесцентных микроскопов, в которых есть специальный осветитель, содержащий ртутную лампу со светофильтром, пропускающим УФ излучение.

Люминесцентные зонды и метки.

Флуоресцентные зонды. В медицине используется применение специальных флуоресцирующих молекул, добавляемых к исследуемым биологическим системам извне, в которых они распределяются в соответствии со своими свойствами. Такие молекулы получили название флуоресцентных зондов. Примером использования флуоресцентных зондов является метод флюоресцентной ангиографии – контрастирование сосудов флуоресцеином и их последующее фотографирование. Этот краситель вводится внутривенно пациентам. Этот краситель не токсичен, обладает очень высоким квантовым выходом флуоресценции. Он разносится с током крови по всему организму и диффундирует в дерму и эпидермис. Флуоресцеин возбуждается невидимым длинноволновым ультрафиолетовым излучением. Люминесценция его наблюдается в видимом свете. Диагностическая значимость этого метода заключается в том, что по скорости появления флуоресценции (люминесценции) в поверхностных тканях судят об участках тела с пониженным кровообращением, в них флуоресцеин появляется позже, чем в участках тела с нормальным кровообращением.

Флуоресцентные метки. Флуоресцирующие молекулы можно ковалентно связывать с определенными молекулами и затем эту систему ввести в исследуемый объект. Такие молекулы называются флуоресцентными метками. Примером является использование флуоресцентно-меченых антител. Если добавить такие антитела к суспензии смеси клеток, то они связываются только с теми из них, на поверхности которых находятся специфические к данному антителу антигены. Возникает яркая люминесценция определенных клонов клеток, наблюдаемая в люминесцентном микроскопе. Данная методика используется в иммунологических исследованиях крови.

Люминесцентный анализ применяют в самых различных областях науки и практики. Так, в криминалистике облучение ультрафиолетом позволяет обнаружить невидимые следы крови, причем свечение крови человека отличается от свечения крови животных и птиц. По-разному люминесцируют настоящие и фальшивые деньги, подписи, сделанные разными, но неразличимыми на глаз чернилами. Люминесцентный анализ позволяет устанавливать подлинность картин или позднейших наслоений на них, так как краски разных сортов, хотя и неразличимые глазом, светятся при ультрафиолетовом облучении по-разному.

Широкое применение нашел люминесцентный анализ в санитарной экспертизе, которую проводят для контроля продуктов питания на мясомолочных контрольных станциях, в пищевых ветеринарных лабораториях и на рынках. Визуальная экспертиза позволяет проводить экспресс-анализ качества продуктов. Так, цвет мяса при облучении его ультрафиолетом по мере его постепенной порчи изменяется от красно-фиолетового до зеленовато-голубоватого, рыбы – от серого до желто-зеленого, молока – от зеленовато-желтого до синего и т. п. Весьма существенно, что люминесцентный анализ позволяет в считанные минуты определить начальную стадию порчи продуктов питания.

Помимо визуального метода используют и люминесцентную микроскопию. Обычный биологический микроскоп снабжают источником УФ освещения и соответствующими светофильтрами. По виду свечения микропрепаратов, приготовленных из продуктов питания, можно распознавать виды возбудителей инфекционных заболеваний: туберкулеза, сибирской язвы, сальмонеллеза и пр. Метод иммунофлуоресценции в последнее время широко используют для ранней диагностики инфекционных заболеваний. Визуальный метод также позволяет проводить диагностику некоторых заболеваний. Например, если стригущий лишай у вызван грибами типа Micro-sporum (микроспория), то волосы при УФ облучении светятся ярко-зеленым светом, причем по внешнему виду могут не отличаться от здоровых волос. Люминесцентный анализ позволяет также определять наличие подкожных кровоизлияний (по тушению люминесценции гемоглобином), аномалии в пигментации (по отсутствию свечения пигментированной кожи) и многое другое.