Биотестирование на инфузориях

Инфузории как тест-организмы

Из всех функций простейших (тест-реакций), изменяющихся под действием тех или иных факторов, наиболее доступны для фиксации в опытах следующие: изменение подвижности, гибель организма и скорость размножения. Для получения максимума информации эти реакции можно выстроить во временную систему: изменение подвижности за время 15-30мин; гибель отдельных клеток за время 1-4часа; снижение скорости размножения (1- 3суток); гибель популяции (4-30суток).

Изменение подвижности – ориентировочный параметр при оценке токсичности, т.к. на движение у простейших расходуется всего 1% энергии общего обмена, следовательно, эта функция незначительно отражает изменения метаболизма клетки при его нарушениях токсичными агентами. Гибель отдельных клеток – достаточно надежная реакция, но с ее помощью невозможно выявить низкие концентрации токсикантов. Большей чувствительностью обладает биотест на основе оценки скорости размножения.

Использование для токсикологической оценки в экологии и сельском хозяйстве инфузорий, началось более чем 30 лет назад. Практические методы биотестирования кормов на инфузориях в нашей стране достаточно популярны. Эти разработки отличают современный комплексный подход, который наиболее полно отражен в методических рекомендациях «Комплексная биологическая оценка объектов природного и искусственного происхождения на Tetrahimena pyriformis» (Богдан А.С.). В этом методе для получения токсикологических характеристик пищевых продуктов, упаковочных материалов в пищевой отрасли и объектов окружающей среды разработана единая методическая схема комплексной биологической оценки на инфузориях Tetrahymena pyriformis. Схема включает 3 этапа:

1. Первичная токсикологическая оценка, включающая 96 часовую экспозицию исследуемых проб с популяцией инфузорий. В течение этого времени фиксируется острая токсичность пробы через 6 часов, через 24 часа – подострая, а через 48-96 часов – хроническая токсичность. По минимальным изменениям жизнедеятельности организмов без их гибели оценивается порог токсического действия.

2. При оценке объектов в хроническом эксперименте препараты и продукты исследуются в концентрациях, не проявивших выраженного токсического действия на предыдущем этапе. По закономерностям роста популяции в течение 96 часов (4 суток) можно определить адаптогенные свойства, иммуномоделирующее действие и мутагенную активностьисследуемых объектов.

3. В пролонгированном экспериментев течение 384 часов (16 суток) проводятся уточняющие исследования результатов, оценка производится на основе анализа характера роста популяции и сравнения реакции на повышенные концентрации исследуемых проб опытной и контрольной популяций.

Методологические подходы в исследованиях с использованием инфузорий многообразны и зависят от целей и задач в каждом конкретном случае. В фармацевтических, медицинских, токсикологических и экологических исследованиях наиболее распространены методы микроскопирования, их применяют в 90% методик. Как правило, это различные модификации подсчета клеток под микроскопом визуально или с помощью автоматизированной системы.

 

Автоматизация биотестирования

Два вида инфузорий используемых при автоматизированном биотестировании (БиоЛаТ)

В этой системе используются 2 наиболее распространенных в биотестировании вида: Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis.


Возможные технические реализации автоматизированного биотеста на инфузориях

Автоматизация биотестирования в первую очередь решает задачу регистрации количества клеток в течение определенного времени экспозиции их в пробе исследуемого объекта. Такая регистрация возможна сегодня с помощью фотометрического метода (фактически определяется концентрация клеток) или с помощью подсчета живых клеток путем ввода изображения емкости с пробой и тест-организмами в компьютер и обработки изображения компьютерной программой.

Фотометрический метод довольно широко используется для регистрации состояния различных тест-организмы, таких как одноклеточные водоросли и бактерии. Для инфузорий имеющих размеры в 10-100 раз больше, чем перечисленные организмы, становится реальным реализация второго способа. Т.е. при фиксировании отдельных кадров изображения емкости с инфузориями, это изображение целиком умещается в кадре и изображения инфузорий достаточно большие для их надежного распознавания и подсчета.

Примером реализации первого способа автоматизации биотеста на инфузориях является прибор Биотестер. Это – импульсный фотометр, позволяет определять степень токсичности природных и сточных вод, донных осадков по хемотаксической реакции инфузорий, таких как Tetrahymena pyriformis и Paramecium caudatum. Измеряемой величиной является концентрация тест-объектов в кювете при добавлении исследуемой пробы. Кювета представляет собой трехслойный «сэндвич», в нижней части которого находятся инфузории в воде, далее - поливиниловый спирт, как разделитель водных фаз, и сверху - исследуемая проба. В случае безвредности пробы инфузории, через 15 минут перемещаются вверх.

Второй способ лежит в основе прибора БиоЛаТ, описанного далее. Общий алгоритм состоит в циклическом подсчете инфузорий во всех заданных и загруженных пробами емкостях (лунках). Через каждые «n» подсчетов (первый цикл) производится вывод промежуточного результата, для информирования оператора о ходе опыта. На основании всех произведенных подсчетов инфузорий по каждой пробе вычисляются относительные количества выживших тест-организмов и, в соответствии с принятыми критериями оценивается степень безопасности исследуемого продукта. Продолжительность первого этапа биотестирования составляет 1- 4 часа.

Далее возможно проведение уточняющего второго этапа в течение времени от 24 часов и выше. Длительность экспозиции зависит от вида инфузорий и от выбранной методики исследования.

Критерии для оценки полученных результатов вырабатываются в процессе разработки методики и, как правило, такие критерии имеют 3 - 4 градации, например, очень токсичный, токсичный, слаботоксичный и нетоксичный объект.

Таким образом, результатами представленного способа автоматизированного биотестирования являются динамика изменения количества инфузорий в течение экспозиции как в первом так и во втором этапе, и оценка, полученная путем сравнения количества инфузорий до введения пробы и после экспозиции их в пробе.