Тиминовые димеры «расшиваются» путем прямой репарации

Рис.

РЕПАРАЦИЯ ДНК

 

Передача наследственной информации в неискаженном виде — важнейшее условие выживания как отдельного организма, так и вида в целом. Большинство изменений в структуре ДНК совершенно недопустимы: они либо ведут к вредным мутациям, либо

блокируют репликацию ДНК и вызывают гибель клеток. Между тем ДНК постоянно подвергается химическим изменениям в результате воздействия как спонтанных, так и индуцированных факторов среды.

К спонтанным повреждениям относятся: ошибки репликации (в результате появляются

некомплементарные пары нуклеотидов — мисмэтчи); апуринизация (отщепление азотистых оснований от сахаро-фосфатного остова — образование АР-сайтов) и дезаминирование (отщепление аминогруппы от азотистого основания).

 

К индуцируемым повреждениям принято относить: димеризацию (сшивание соседних пиримидиновых оснований с образованием димера); размыкание пуринового кольца; однонитевые и двунитевые разрывы в ДНК; сшивки между цепями ДНК.

 

В ходе эволюции выработалась система, позволяющая исправлять нарушения в ДНК, вызванные ошибками репликации или повреждающими агентами внешней среды, — система репарации ДНК. В результате ее активности на 1000 повреждений в ДНК только одно приводит к мутации. Нарушения в системе репарации могут приводить к преждевременному старению, развитию онкологических заболеваний, болезням аутоиммунной системы и целому ряду других генетически обусловленных дефектов. Так, у людей, страдающих пигментной ксеродермой (наследственное заболевание,

выражающееся в очагах рака кожи), нарушение системы репарации приводит к тому, что они не могут бывать на солнечном свету в силу полной незащищенности от УФ-облучения.

Установлено, что в геноме зародышевой линии клеток млекопитающих и человека

происходит в среднем 6 нуклеотидных замен в год. Вероятно, и в соматических клетках происходит такое же количество мутаций.

Их накопление с возрастом повышает вероятность ракового перерождения клеток. В целом полагают, что 80 — 90% всех раковых заболеваний связаны с отсутствием репарации ДНК. Многие другие наследственные болезни человека также связаны с дефектами в работе системы репарации. К ним, в частности, относят триходистрофию

(нехватка серы в клетках волос, ведущая к их ломкости; аномалии кожи и зубов; дефекты полового развития), синдром Кокэйна (карликовость, глухота, атрофия зрения и др.); анемия Фанкони (уменьшение количества всех клеточных элементов

крови, скелетные нарушения, микроцефалия, потеря слуха).

 

Известны четыре основных типа повреждений в ДНК: повреждение одиночных нуклеотидов; повреждение пары нуклеотидов; разрыв цепей ДНК; образование поперечных сшивок между основаниями одной цепи или разных цепей ДНК.

 

 

Система репарации способна противостоять всем типам повреждений в ДНК, однако механизмы репарации наиболее изучены только в отношении первых двух типов, в основе которых лежат изменения структуры гетероциклических азотистых оснований.

Устранение разрывов в цепях ДНК, вероятно, достигается прямым лигированием с участием ДНК-лигаз, либо в процессе рекомбинации молекул ДНК, а механизмы устранения поперечных сшивок пока не изучены.

 

Наиболее часто наблюдаемые повреждения нуклеотидов включает окисление, дезаминирование и алкилирование азотистых оснований, образование пиримидиновых димеров, а также вставку нуклеотидов или включение оснований-аналогов (образование неканонических пар оснований), гидролиз N-гликозидных связей между основанием и дезоксирибозой (апуринизация).

 

Апуринизация— гидролитическое выщепление азотистых (преимущественно

пуриновых) оснований из полинуклеотидной цепи ДНК — приводит к образованию так называемых АР-сайтов.В целом термин «АР-сайт» объединяет все случаи выщепления оснований с образованием и апуриновых, и апиримидиновых сайтов. Полагают, что ежедневно ДНК каждой клетки человека теряет от 5000 до 10 000 пуриновых

оснований, которые должны быть замещены (вставлены) ферментами репарации.

 

Алкилирование ДНК происходит при участии алкилирующих реагентов (мутагенов), большинство из которых являются канцерогенами.

 

Нитрозоамины могут возникать из вторичных аминов и азотистой кислоты и ее солей (нитритов), которые в свою очередь образуются в организме человека в процессе восстановления нитратов, поступающих с пищей.

 

К числу наиболее мощных алкилирующих реагентов относятся иприт и его производные. Производные иприта способны вызывать многочисленные поперечные сшивки в молекуле ДНК, которые ведут к летальному исходу.

 

Окисление азотистых оснований в ДНК вызывается различными активными формами кислорода (АФК). Среди них наиболее выраженными окислительными свойствами обладают супероксиданионрадикал (О₂*) и одноэлектронный гидроксил (*ОН). Оба эти соединения могут вызывать окислительные повреждения в ДНК: размыкание пуринового кольца, либо окисление пуринов, что ведет к трансверсиям.

 

Тиминовые димеры возникают в ДНК за счет образования ковалентных связей между соседними тиминами, расположенными в одной цепи ДНК. Этот процесс вызывается УФ-облучением.

 

Рис.173 (Коничев А.С.,с.334)

Наиболее часто выявляемые повреждения в нуклеотидах ДНК:

I— дезаминирование; II — апуринизация; III — метилирование; IV— размыкание

кольца; V — окисление; VI — образование тиминовых димеров

 

 

Системы репарации достаточно консервативны в эволюции от бактерий до человека и наиболее изучены у Е. coli.

 

Известны два типа репарации: прямая и эксцизионная (от англ. excision — вырезание). Прямая репарация — наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в

одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. АР-сайты, например, могут репарироваться путем прямой вставки пуринов при участии ферментов, называемых ДНК-инсертазами (от англ. insert — вставлять).

 

С.337

Рис. 174. Примеры прямой репарации повреждений в ДНК:

А — метилированное основание (О⁶-mG) демитилируется ферментом метилтрансферазой,

которая переносит метильную группу на один из своих остатков цистеина;

Б — фотолиаза присоединяется к тиминовому димеру, и после облучения этого комплекса видимым светом (300 – 600нм) димер расшивается.

 

при участии фотолиаз, осуществляющих соответствующее фотохимическое превращение (рис. 174, Б). ДНК-фотолиазы представляют собой группу ферментов, активируемых светом, с длиной волны 300 — 600 нм (видимая область), для чего в их структуре имеется особый светочувствительный центр. Они широко распространены в природе и обнаружены у бактерий, дрожжей, насекомых, рептилий, земноводных и человека. Эти ферменты нуждаются в разнообразных кофакторах (FADH, тетрагидрофолиевая кислота и др.), участвующих в фотохимической активации фермента. Фотолиаза Е. coli представляет собой белок с молекулярной массой 35 кДа, прочно связанный с олигорибонуклеотидом

длиной 10—15 нуклеотидов, необходимым для активности фермента.

 

Эксцизионная репарация включает удаление поврежденных азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.

 

В эксцизионной репарации обычно принимают участие несколько ферментов, а сам процесс затрагивает не только поврежденный, но и соседние с ним нуклеотиды. Кроме этого, для эксцизионной репарации необходима вторая (комплементарная) цепь ДНК.

Общая упрощенная схема эксцизионной репарации представлена

на рис. 175.

 

Первым этапом эксцизионной репарации является вырезание аномальных азотистых оснований. Его катализируют ДНК-N-гликозилазы — ферменты, расщепляющие гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием. У человека ДНК-N-гликозилазы обладают высокой субстратной специфичностью: разные ферменты этого семейства распознают и вырезают различные аномальные основания (8-оксогуанин, урацил, метилпурины и др.). В результате действия ДНК-N-гликозилазы образуется

АР-сайт, который атакуется ферментом АР-эндонуклеазой. Она разрывает сахарофосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте и тем самым создает условия для работы следующего фермента — экзонуклеазы, которая последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК. У бактерий

освобожденное место далее заполняется соответствующими нуклеотидами при участии ДНК-полимеразы I, ориентирующейся на вторую (комплементарную) цепь ДНК. Поскольку ДНК полимераза I способна удлинять З'-конец одной из цепей в месте

разрыва в двуцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва, т. е. осуществлять ник-трансляцию, этот фермент играет ключевую роль в репарации ДНК. Окончательное сшивание репарированных участков осуществляет ДНК-лигаза.

 

Эксцизионная репарация ДНК в клетках млекопитающих сопровождается резким всплеском активности еще одного фермента — поли(АDР-рибозо)-полимеразы. При этом происходит ADP- рибозилирование белков хроматина (гистонов и негистоновых белков), что ведет к ослаблению их связи с ДНК и открывает доступ ферментам репарации. Донором ADP-рибозы в этих реакциях выступает NAD+, запасы которого сильно истощаются при эксцизионной репарации повреждений, вызываемых рентгеновским

облучением: рис.с.339

 

ДНК-гликозилазы, участвующие в устранении окислительных повреждений ДНК в клетках прокариот и эукариот, весьма разнообразны и отличаются по субстратной специфичности, пространственной структуре и способам взаимодействия с ДНК.

К наиболее изученным ДНК-гликозилазам относятся эндонуклеаза III (EndoIII), формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg), Mut Т и Mut Y кишечной палочки.

 

Эндонуклеаза III Е. coli «узнает» и специфически выщепляет из ДНК окисленные пиримидиновые основания. Этот фермент представляет собой мономерный глобулярный белок, состоящий из 211 аминокислотных остатков (мол. масса 23,4 кДа). Ген, кодирующий EndoIII, секвенирован, установлена его нуклеотидная последовательность. EndoIII представляет собой железосерный белок [(4Рс-45)2+-белок], обладающий элементом надвторичной структуры типа «греческий ключ» (спираль — шпилька — спи-

раль), служащим для связывания с ДНК. Ферменты с аналогичной субстратной специфичностью и сходной аминокислотной последовательностью выделены также из клеток быка и человека.

 

В последнее время в эксцизионной репарации особое внимание уделяют АТР-зависимому механизму удаления повреждений из ДНК. Этот вид эксцизионной репарации получил название нуклеотидная эксцизионная репарация (nucleotide excision repair; NER). Она включает в себя удаление из ДНК олигонуклеотидных фрагментов,

содержащих повреждение, и последующую реконструкциюцепи ДНК с участием комплекса ферментов (нуклеаз, ДНКполимеразы, ДНК-лигазы и др.). Удаление фрагмента ДНК происходит по обе стороны поврежденного нуклеотида. Длина удаляемых

олигонуклеотидных фрагментов отличается у прокариот и

эукариот. Так, у Е. coli, вырезается фрагмент длиной 12—13 нуклеотидов, а у дрожжей, земноводных и человека — фрагмент, состоящий из 24 — 32 нуклеотидов.

 

Эксцизионные репарации у человека также имеют АТР-зависимый

характер и включают три основных этапа: узнавание повреждения,

двойное разрезание цепи ДНК, восстановительный синтез и лигирование рнепарируемой цепи.

В эксцизионной реперации ДНК человека принимают участие 25 различных полипептидов, 16 из которых участвуют в выщеплении олигонуклеотидного

фрагмента, являясь протомерами эксинуклеазы, а остальные осуществляют

синтез репарируемого участка молекулы. В репарационной

системе ДНК у человека весьма существенную роль выполняют

белки транскрипции — РНК-полимераза II и TF IIН — один из шести основных факторов транскрипци эукариот.

 

Репарация ошибок репликации ДНК. Ошибки спаривания азотистых оснований во время репликации ДНК происходят достаточно часто (у бактерий один раз на 10 тыс. нуклеотидов), в результате которых в дочернюю цепь ДНК включаются некомплементарные нуклеотидам материнской цепи нуклеотиды — мисмэтчи (от англ. mismatch). Несмотря на то, что ДНК-полимераза I прокариот обладает способностью к самокоррекции, ее I усилия по устранению ошибочно присоединенных нуклеотидов

I иногда оказываются недостаточны, и тогда в ДНК остаются некоторые неправильные (некомплементарные) пары. В этом случае репарация происходит с использованием определенной системы, связанной с метилированием ДНК. Действие этой системы репарации основано на том, что после репликации через определенное время (несколько минут) ДНК подвергается метилированию.

 

У Е. coli метилируется в основном аденин. До этого вновь синтезированная (дочерняя)

цепь остается неметилированной. Если в такой цепи есть неспаренные нуклеотиды, то она подвергается репарации: метилирование как бы метит ДНК и включает систему исправления ошибок репликации. В устранении неспаренных нуклеотидов в полуметилированной молекуле ДНК принимает участие достаточно сложный комплекс ферментов репарации, который сканирует поверхность молекулы ДНК, вырезает участок дочерней цепи, прилегающей к мисмэтчам, а затем создает условия для застраивания его нужными (комплементарными) нуклеотидами.

 

Рис. 173 (176). Система репарации, связанная с метилированием ДНК (пояснения

в тексте)

 

Различные компоненты этого комплекса обладают разными активностями (нуклеазной,

хеликазной, АТРазной), необходимыми для внесения разрывов в ДНК и выщепления нуклеотидов, расплетания двойной спирали ДНК и энергетического обеспечения движения комплекса вдоль репарируемой части молекулы. Сходный по структуре

и функциям комплекс ферментов репарации выявлен и у человека.

 

 

Рекомбинантная (пострепликативная) репарация. В тех случаях, когда по тем или иным причинам вышерассмотренные системы репарации оказываются нарушенными, в цепях ДНК могут образовываться бреши (недорепарированные участки), имеющие иногда

весьма существенные размеры, что чревато нарушением системы репликации и может привести к гибели клеток. В этом случае клетка в состоянии использовать для репарации одной молекулы ДНК другую полученную при репликации молекулу ДНК, т.е. привлечь

для этой цели механизм рекомбинации. У бактерий в рекомбинантной репарации принимает участие белок Rec А. Он связывается с одноцепочечным участком ДНК и вовлекает его в рекомбинацию с гомологичными участками неповрежденных цепей

другой молекулы ДНК. В результате и разорванная (содержащая бреши), и неповрежденная цепи репарируемой молекулы ДНК оказываются спаренными с неповрежденными комплементарными участками ДНК, что открывает возможность репарации путем вышеохарактеризованных систем. При этом могут происходить

вырезание определенного фрагмента и заполнение с его помощью бреши в дефектной цепи. Возникающие при этом пробелы и разрывы в цепях ДНК восполняются с участием ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы.

 

SOS-репарация. Существование этой системы впервые постулировал М. Радман в 1974 г. Он же дал название этому механизму, включив в него международный сигнал бедствия «SOS» (спасите наши души). И действительно, эта система включается тогда, когда

повреждений в ДНК становится настолько много, что угрожает жизни клетки. В этом случае происходит индукция активности разнообразной группы генов, задействованных в различных клеточных процессах, сопряженных с репарацией ДНК.