Качественный спектрофотометрический анализ.
КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Биомолекул
Качественный анализ вещества предполагает, во-первых, молекулярный анализ – обнаружение в веществе определённых молекул, во-вторых, структурный анализ – обнаружение отдельных структурных фрагментов и определение их взаимного расположения.
Качественный спектрофотометрический анализ основан на том, что каждое соединение имеет характерный для него спектр поглощения. Положение и интенсивность полос поглощения вещества определяется содержащимися в нём хромофорными группами.
Для отождествления измеренного спектра поглощения со спектром какого-либо вещества определяют следующие параметры (слайд 6):
1) количество максимумов в спектре поглощения;
2) спектральное положение максимумов ( lmax ) полос поглощения;
3) полуширину полос поглощения ( Dl1/2 ) - разность между двумя длинами волн, при которых оптическая плотность составляет половину от максимальной;
4) амплитуду максимумов ( e max );
5) отношение амплитуд максимумов ( e1max / e2max ).
При этом необходимо помнить, что экспериментальные условия, при которых проводятся абсорбционные измерения, существенным образом влияют на форму спектра поглощения. Так, в частности, все перечисленные выше параметры могут изменяться в зависимости от рН среды, ее температуры, полярности растворителя, концентрации исследуемого вещества и т.д.
Далее спектр исследуемого соединения сравнивают с полученным при таких же экспериментальных условиях спектром данного соединения, приведённым в литературе или с полученным ранее с использованием заведомо известного образца. Наличие в исследуемом спектре всей совокупности полос с совпадающими с точностью до 1 нм положениями максимумов и до 10% значениями максимальных коэффициентов экстинкции свидетельствует о тождественности исследуемого и сравниваемого соединений. Появление лишних полос или увеличение интенсивности отдельных максимумов может быть вызвано присутствием примесей в исследуемом растворе.
Спектральные характеристики отдельных хромофорных групп сильно отличаются по величине. Поэтому для обнаружения определённых функциональных групп следует записывать спектры таких растворов, концентрация которых даёт возможность получить искомую полосу с оптимальной оптической плотностью в пределах 0,2 – 0,8. При использовании стандартных сантиметровых кювет концентрации (С) можно подбирать из соотношения С » 0.43 / e max.