Метод локальной фиксации напряжения (пэтч-кламп).

Ионные каналы биоло­гических мембран исследуют главным образом с помощью метода локальной фик­сации напряжения, называемого также методом пэтч-кламп. В этом методе на­пряжение фиксируют на микроучастке клеточной поверхности, что позволяет ре­гистрировать токи одиночных ионных каналов. Первые такие измерения, были осуществлены Э. Неером и Б. Сакманом в 1976 г. Этот метод позволяет регистрацию токов в микроучастках мембраны диаметром примерно 1 мкм и позволяет идентифици­ровать молекулярные реакции одиночных каналов на основе зависимостей ионных токов от потенциа­ла и времени (слайд 4). Стеклянная микропипетка, диаметр кончика которой меньше 1 мкм, подводится к клетке вплоть до контакта с мембраной, и когда через пипетку по­дается отрицательное давление, пипетка обычно закупоривается участком мембраны; электрическое сопротивление между пипеткой и внеклеточным раствором возрастает скачком более чем до 5 ГОм (10⁹ Ом).

В результате микроучасток мембраны электрически изолируется от остальной мембраны. Канал пипетки соединен с усилителем обратной связи, который обеспечивает регулирующую цепь для поддержания потенциала пипетки на заданном уровне. Ток, необходимый для стабилизации потен­циала-«ток фиксации» - точно соответствует току, протекающему в каждый момент через микроуча­сток мембраны.

Благодаря механической прочности контакта между стеклом в торце микро­пипетки и клеточной мембраной мембранный фрагмент можно отделить от клет­ки, получив доступ к его внутренний поверхности, либо разрушить мембранную перегородку в кончике пипетки и получить сравнительно низкоомный контакт с внутриклеточной средой. В зависимости от условий различают несколько вари­антов измерений: 1) на микроучастке мембраны с прикрепленной клеткой, 2) на изолированном участке мембраны с внешней поверхностью, обращенной внутрь пи­петки, 3) на изолированном фрагменте, внешняя поверхность которого обращена наружу, 4) измерение интегральных токов на целой клетке (метод внутреннего диализа).

2.3. Ионные токи при возбуждении Временной ход Na⁺ и К⁺ - токов и изменений проводимости.

Деполяризация, возникающая во время возбуждения, изменяет проводимость мембраны для различных ионов, а сдвиг проводимости в свою очередь вызывает изменение потенциала.

В ответ на ступенчатую деполяризацию аксона кальмара от потенциала покоя до 0 мВ регистрируется мембранный ток, состоящий их 4^х компонентов (слайд 2). Емкостной ток J_с представляет собой кратковременный импульс, который в основном заканчивается к моменту выхода напряжения на плато. Некоторые дипольные молекулы в мембране медленно меняют свою ориентацию после наложения ступенчатого напряжения, что приводит к появлению небольшого по амплитуде "хвоста" емкостного тока, который относительно медленно спадает. После спада J_с мембранный ток полностью определяется движением ионов через каналы в мембране.

В ионном токе можно выделить два основных компонента (Na⁺ и К⁺ токи) и один второстепенный – ток утечки J_e.

Рассматривая основные компоненты: калиевый и натриевый токи, необходимо отметить, что натриевый ток обусловлен преимущественно кратковременным потоком Na⁺, проходящим через Na⁺-каналы. Этот ток быстро уменьшается и спустя примерно 1мс сменяется входящим К⁺- током.

Временной ход Na⁺ и К⁺ - токов и изменений
проводимости.

Ток фиксации J, возникающий в ответ на скачок деполяризации состоит таким образом из Na⁺ и К⁺ токов (J_Na и J_K) и зависит от мембранного потенциала. Эквивалентная схема, используемая при интерпретации данных в опытах по фиксации потенциалов предполагает, что токи, текущие по Na⁺ и К⁺ каналам подчиняются уравнениям:

, , (1).

Если во время развития ионного тока скачком сместить мембранный потенциал на новый уровень, то ток тоже изменится скачком. Изменение тока Na⁺ и К⁺ во времени в режиме фиксации напряжения обусловлено изменением проводимостей g_Na и g_k поскольку величина остается постоянной в течение всего импульса. При ступенчатой деполяризации мембраны Na⁺-проводимость начинает изменяться от чрезвычайно малой величины, быстро нарастает до 25 мОм/см², а затем экспоненциально уменьшается (слайд 3).

Проводимость для К⁺ нарастает по S-образной кривой и выходит на постоянный уровень через 5-6 мин. Изменения проницаемости для Na⁺ и К⁺ градуальны и обратимы. Натриевая проводимость восстанавливается примерно в 10 раз быстрее, чем калиевая.

Na-проводимость может быть уменьшена двумя разными способами. Если мембранный потенциал возвратить на исходный уровень через короткий промежуток времени, то система, регулирующая Na⁺-проницаемость, быстро возвращается к состоянию покоя. Второй импульс, нанесенный сразу же после первого, вызывает в этом случае повторное увеличение Na⁺-проводимости. Если же деполяризация продолжительна, Na⁺-проводимость уменьшается более медленно вследствие процесса, называемого инактивацией. Для того что бы второй импульс после инактивации Na⁺-каналов мог снова вызвать изменение проницаемости для Na⁺ , мембрана в течение нескольких миллисекунд до начала второго импульса должна быть реполяризована.