Основы фармакогенетики.

У бактерий и вирусов.

Передача наследственной информации

Лекция 8

Бактерии имеют плотную клеточную оболочку, под которой находится эластичная, тонкая протоплазматическая мембрана. В цитоплазме бактерий есть небольшие образования, так называемые плазмиды (эписомы). Это небольшие кольцевые двуцепочечные молекулы ДНК, которые могут существовать автономно (реплицироваться с помощью ферментов клетки бактерии независимо от основной хромосомы) или входить в состав молекулы ДНК, которая находится в хромосоме бактерии. Термин «плазмиды» предложен Дж. Ледербергом в 1952 г. Маленькие плазмиды включают 10-30 тыс.пар оснований, и в клетке имеется их от 10 до 100 копий. Большие плазмиды содержат до 100 тыс. пар оснований, но в клетке они представлены одной-двумя копиями. Изучены факторы (R-факторы) устойчивости к лекарственным веществам (стрептомицину, тетрациклину, сульфаниламидам). Термин «эписомы» предложен Ф.Жакобом и Э.Вольманом (1958). Есть эписома, которую называют половым фактором F+. Она выполняет функцию обмена генетическим материалом между бактериальными клетками.

Кишечная палочка (Escherichia coli) обладает гаплоидным набором хромосом, является быстрорастущим организмом, который можно культиворовать на синтетической среде. В бактериях происходит обмен генетической информацией, который приводит к возникновению новых рекомбинативных генотипов, однако процессы, которые приводят к такому обмену, существенно отличаются от оплодотворения и мейоза, характерных для высших организмов. Эти процессы называются парасексуальными и включают в себя такие формы, как сексдукция, трансформацияи трансдукция. Парасексуальные процессы – это обмен генетической информацией между клетками разных штаммов бактерий и вирусов.

Сексдукция – это перенесение генетического материала от одной бактерии к другой с помощью полового фактора (F+) при коньюгации. Впервые процесс коньюгации у бактерий обнаружили Дж.Ледеберг и Э.Татум в 1946 г. В 1952 г. Хейс установил неравноценную роль родительских штаммов при коньюгации. Выяснилось, что один штамм является донором (мужским), а другой – реципиентом (женским). F+ - это присутствующий половой фактор, что характерно для мужских клеток бактерий, F- - это отсутствующий половой фактор, что характерно для женских клеток бактерий.

Клетки-доноры обладают половым фактором F+, который является коньюгативной плазмидой и представляет собой циркулярно замкнутую молекулу ДНК. При коньюгации клетки доноры F+ соединяются с клетками-реципиентами F- при помощи коньюгационного мостика – особой протоплазматической трубки, образуемой клеткой F+. При коньюгации фактор F+ обычно не передается, так как располагается в конце хромосомы. С более высокой частотой передаются гены, расположенные около начальной точки хромосомы донора. Затем ДНК донора в гомологичных участках вступает в контакт с ДНК реципиента и в результате кроссинговера, некоторые участки одной цепи ДНК реципиента заменяются фрагментами ДНК донора. При коньюгации половой фактор вместе с фрагментами ДНК иногда переходит в женскую клетку, превращая ее в мужскую и передавая ей свойства, контролируемые фрагментом хромосомы донора. Мостик между коньюгирующими клетками хрупок, и перенос всей хромосомы донора, который при 37⁰С занимает 90 минут редко доходит до конца. При данной температуре перенос происходит с постоянной скоростью. Большая скорость деления бактериальных клеток за короткий промежуток времени, обуславливает их показательное использование в генетических исследованиях.

Трансформация – это процесс передачи наследственной информации от одного штамма бактерий другому вследствие перенесения ДНК. Такое явление впервые обозначил Ф.Гриффитс в 1928 г. на пневмококках. В 1944 году Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти осуществили химическую идентификацию трансформирующего начала. Они убивали клетки пневмококков нагреванием, экстрагировали с помощью лизиса в присутствии детергента и после осаждения абсолютным этанолом и депротеинизации хлороформом получали трансформирующее начало в высокоактивной форме. Конечный продукт давал отрицательную реакцию на белок и и РНК и резкоположительную реакцию на ДНК. Трансформирующая активность препарата была устойчива к протеолитическим ферментам и рибонуклеазе, но разрушалась под действием ферментов, расщепляющих ДНК. С помощью этих экспериментов было твердо установлено, что ДНК способна переносить генетическую информацию от одной бактерии к другой.

Трансдукция- Это перенос генов из одной бактериальной клетки в другую при участии определенных бактериофагов. Впервые явление трансдукции установили Н.Д.Циндер и Дж.Ледеберг в 1952 г. По строению бактериофаги – это вирусы, паразитирующие в бактериальных клетках. У бактериофагов ДНК заключена в головке фага. Если фаг вирулентный, то инфицирование этим фагом чувствительной клетки-хозяина приводит к ее лизису и высвобождению фагов-потомков. Фаговые частицы прикрепляются к специфическим участкам бактериальной клеточной стенки с помощью фибрилл отростка. Чехол отростка сокращается, и содержимое головки проникает внутрь бактерии, как бы впрыснутое шприцем. Фаговая ДНК проходит через отросток в бактериальную клетку, подавляя белоксинтезирующие механизмы клетки-хозяина, и заставляет их синтезировать компоненты фага, используя в качестве матрицы фотоспецифические мРНК. Есть и такие фаги, которые, инфицируя клетку, не обязательно вызывают ее лизис. Подобно коньюгации, трансдукция – однонаправленный перенос. Трансдуцированные гены донора включаются в тот участок бактериальной хромосомы, в котором расположены гомологичные гены реципиента. Иногда трансдуцированный фрагмент ДНК не интегрируется, а остается в цитоплазме бактерии; в этом случае он не может делиться, но способен транскрибироваться и транслироваться. Это абортивная трансдукция; она обусловливает гетерозиготность по генам, содержащимся в перенесенном фрагменте, и позволяет исследовать функцию генов и их взаимодействие.

Эксперимент Френкель-Конрата в 1955 г. отчетливо показал, что именно РНК определяет взаимодействие вируса и клетки-хозяина, а также генотип и фенотип вирусного потомства. В 1956 г. Гигер и Шрамм показали, что генетическим материалом ряда вирусов, а в частности вируса табачной мозаики (ВТМ) является одноцепочечная молекула РНК.

 

Основы фармакогенетики

 

Фармакогенетика – наука о роли генетических факторов в индивидуальной, видовой, половой и возрастной восприимчивости организмов к лекарственным веществам, метаболизме этих веществ, толерантности, лекарственной зависимости, кумуляции, потенциировании и антагонизме. Фармакогенетика – это новый прикладной междисциплинарный раздел генетики и фармакологии (науки, изучающей действие лекарственных веществ на организм животных и людей).

Фармакогенетика изучает:

- реакции организма на действие лекарственных веществ с учетом генетических особенностей отдельных индивидуумов в рамках возрастных, сезонных, половых, видовых особенностей;

- стремление достижения желаемого эффекта при их применении;

- механизм и степень наследования этих реакций в норме и патологии;

- генетику ферментов, которые превращают (метаболизируют) лекарственные вещества в норме и в случае патологических изменений в ферментной системе;

- разрабатывает способы профилактики патологических медикаментозных реакций и лечения органов с такими отклонениями.

Термин «фармакогенетика» ввел в науку в 1959 г. Вогель, который первым заметил существование генетического контроля над реакциями организма на введение лекарственных веществ.

Генетически обусловленные отличия в реакциях организма на лекарственные вещества зависят:

1. От замедленного метаболизма лекарственных веществ, вследствие чего возникает резкая реакция организма на фармакологические препараты (образование недостаточного количества соответствующих ферментов, или с недостаточной их активностью).

2. От ускоренного метаболизма лекарственных веществ, результатом которого является слабая фармакологическая реакция организма и пониженная лечебная эффективность препаратов.

3. От нарушения нормального взаимодействия между лекарственными веществами и метаболитами, что может приводить к образованию вредных химических соединений и негативной реакции организма.

Также могут возникать нетипичные реакции организма на лекарственные вещества, прямо не связанные с генотипом организма, а являются результатом аллергизации, ослабления защитных механизмов организма. Чаще всего это результат ферментных дефектов (энзимопатий).

Энзимопатии – наследственные нарушения структуры и функции ферментов, метаболизирующих лекарственные вещества. Они возникают в результате мутаций определенных генов и играют важную роль в возникновении негативного действия многих лекарственных веществ. В одном случае действие лекарственных веществ усиливается настолько, что обуславливает нежелательные последствия, а в другом – лекарственные вещества провоцируют обострение хронических заболеваний, которые протекали латентно.

 

Широкое применение антибиотиков и других лекарств привело к тому, что генетическая резистентность патогенных бактерий возросла до такой степени, при которой часто затруднено лечение инфекционных болезней. В Англии среди изученных штаммов сальмонелл 61% оказался резистентным к одному или более антибиотиков. В этой же стране в 1977 г. 62,6% штаммов E.coly, выделенных от крупного рогатого скота, были резистентными к стрептомицину и 47% - к тетрациклину, а у свиней – соответственно 5,5 и 47,1%.

У скота, павшего от респираторных болезней, выделено более 50% культур пастерелл, устойчивых к сульфаниламидам и стрептомицину, а 75% были нечувствительны к тетрациклину.

На некоторых фермах в Японии во время эпизоотии сальмонеллеза у телят выделяли до 77% устойчивых к хлорамфениколу штаммов сальмонелл, среди которых 85% были также устойчивы к тетрациклину, стрептомицину и сульфаниламидам. Резистентность полностью передавалась последующим поколениям сальмонелл.

Во многих странах повышение резистентности к различным лекарствам обнаружено у гельминтов и клещей. Установлено, что применение одного препарата ведет к возникновению устойчивости клещей к этому препарату в течение 5-10 лет.

Механизм резистентности микроорганизмов

против лекарственных веществ.

Резистентность микроорганизмов зависит от образования в бактериальных клетках так называемых плазмид – эписом с R–фактором (способным обеспечить устойчивость бактерий против лекарственных веществ). Плазмиды по коньюгационному мостику могут проникать в другую бактерию, даже другого вида, обусловливая или невосприимчивость к определенным лекарственным веществам, или способность к синтезу колицинов. Колициногены включают гены, которые и обусловливают синтез бактерией особых белковых веществ – колицинов. Однако образовавшиеся метаболиты пагубно воздействуют на организм животного или человека, ухудшая состояние здоровья. Периодическое чередование разных лекарственных веществ (в пределах 2-3 суток), как правило, приводит к полной утрате способности бактериальной клетки к быстрому размножению R-факторов, размножению самой клетки и к ее гибели. Некоторые из плазмид способны встраиваться в хромосому бактерии, и тогда при переходе из одной бактерии в другую они, подобно половому фактору, перетягивают за собой часть, а иногда всю хромосому.

Эффективность введения лекарственных веществ зависит от:

- Пола. Мужской пол имеет меньше активных генов, чем женский, вследствие инертности Y-хромосомы. Например женский пол чувствителен к никотину, стрихнину, снотворному, но резистентен к алкоголю.

- Возраста. Новорожденные более чувствительны к лекарственным веществам, чем взрослые. При внутрибрюшном введении новорожденным крольчатам гексабарбитала 75мг/кг приводит к глубокому сну, а затем к гибели. У 10-дневных крольчат сон 1-2 часа, и гибнут 50%. У 16-дневных крольчат – сон 10-20 минут. Взрослые кроли не засыпают. Такие лекарственные вещества, как ацетилхолин, адреналин, никотин у старых животных вызывают реакцию в 3-10 раз выше, чем у молодых.

- Смены дня и ночи. Так морфин, амфетамин наиболее активны в ночное время, а никотинамид – днем. У мышей токсичность этилового спирта вечером и ночью выше, чем утром и днем. Ритмическая деятельность организма полностью зависит от генетического контроля и действия желез внутренней секреции.

- Факторов внешней среды. Температура, свет, радиационный режим, способ содержания (групповой, одиночно), режим кормления, атмосферное давление… Воздействие рентгеновскими лучами снижает действие лекарственных веществ. Одиночное содержание приводит к увеличению активности ферментов, вследствие чего продолжительность сна значительно уменьшается.