Селекция микроорганизмов

Вирусы

Грибы

Род Shigella, виды S.sonnei, S.dysenteriae – патогенные, вызывают пищевые отравления, бактериальную дизентерию.

 

11.5. Спорообразующие палочки

Семейство Bacillaceae, род Bacillus – грам+, крупные палочки, сапрофиты (кроме сибироязвенной), обладают активными протеолитическими свойствами, не любят молочной кислоты; продуценты протеолитических ферментов и антибиотиков; широко распространены в природе. Виды:

Ø B.subtilis – сенная палочка, продуцент антибиотиков (субтилин и др), перспективный объект для генноинженерных работ, продуцент рибофлавина;

Ø B.mycoides – грибовидная палочка, колонии похожи на грибной мицелий;

Ø B. megaterium – капустная палочка;

Ø B. mesentericus - картофельная палочка (вызывают пороки хлеба);

Ø B. cereus- вызывает пищевые отравления, нормируется в продуктах детского питания;

Ø B. anthracis – сибироязвенная палочка, патогенная, возбудитель тяжелого инфекционного заболевания, споры сохраняются в почве столетиями.

Семейство Bacillaceae, род Clostridium – мелкие палочки с характерным клостридиальным расположением спор, строгие анаэробы.

Виды: Cl. butiricum, Cl. tyrobutiricum – возбудители маслянокислого брожения, пороков сыров и других пищевых продуктов.

Cl. tetani - возбудитель столбняка, вырабатывает очень сильный экзотоксин.

Cl. botulinum - возбудитель ботулизма, вырабатывает самый сильный биологический яд; споры выдерживают 5 ч кипячения, но в кислой среде не прорастают.

Cl.perfringens – вызывает токсикоинфекции.

Использование в ПБ:

Cl. thermohydrosulfuricum – синтез этанола, уксусной и молочной кислот;

Cl. thermocaccharolyticum – производство глюкозы, ксилозы, этанола, ускусной кислоты.

 

11.6. Применение принципов систематики на примере важнейшихпрокариот

 

Царство (Regnum) Procaryotae

 

Отдел (Divisio) Fotobacteria Cemobacteria

 

Класс (Klassis) Riccetsia Eubacteria Micoplasma

 

Порядок (Ordo) Eubacteriales

 

Семейство (Familia) Bacillaceae Lactobacillaceae Enterobacteriaceae

 

Род (Genus) Bacillus Lactobacillus Escherichia

 

Вид (Species) B. subtilis Lb.acidophilus E.coli

 

Подвид (Subspecies) B.subtilis subsp. mycoides

 

Штамм B.subtilis 2335/105 (рекомбинантный штамм, использующийся для синтеза субалина – противовирусного анитибиотика)

 

 

 

12. 1. Общие свойства и классификация грибов.

В настоящее время грибы относят к царству Mycota (Fungi). Наука, изучающая представителей этого царства, называется микологией.

По внешним признакам (размеру) грибы делят на микромицеты и макромицеты. К микромицетам (микроскопическим грибам) относятся мицелиальные грибы (плесени) и дрожжи, к макромицетам – шляпочные грибы, грибница которых находится в симбиотических взаимоотношениях с растениями.

Грибы – низшие эукариоты, неподвижны, в клеточных стенках у большинства обнаружен хитин (как у насекомых), запасное питательное вещество – гликоген (как у животных). Многие как растения способны к ветвлению и неограниченному верхушечному росту.

Способ питания – гетеротрофный, путем всасывания растворенных питательных веществ. Способны выделять ферменты, расщепляющие белки, жиры, углеводы, во внешнюю среду, т.е. переваривать пищу вне организма. Среди грибов известны:

o сапрофиты - извлекают питательные вещества из мертвого органического материала, например, Mucor, Penicillium;

o паразиты делятся на облигатные (не вызывают гибели хозяев) и факультативные (вызывают гибель); чаще паразитируют на растениях (например, головня, фитофтора), на животных – при ослабленном иммунитете (например, Candida albicans);

o мутуалисты (в составе лишайников в симбиозе с водорослями, при образовании микоризы как ассоциации с корнями растений).

Некоторые сапрофитные грибы могут вырабатывать вещества, которые являются токсичными для человека и животных (например, афлатоксины в пищевых продуктах).

По отношению к кислороду аэробы, не требовательны к питательным веществам, растут преимущественно на поверхности различных субстратов. Устойчивы к неблагоприятным условиям среды, выдерживают низкие температуры, высокие концентрации осмотически активных веществ.

Размножаются обычно бесполым путем (делением, почкованием, с помощью экзоспор), но периодически способны вступать в циклы полового размножения, что повышает их приспособленность к окружающей среде.

Систематика постоянно совершенствуется, в разных источниках приводится по-разному. По одной из последних классификаций царство Mycotaделят на 2 подцарства:

o низшиегрибыMyxobionta;

o высшие грибы Mycobionta.

Для низших грибов характерно наличие зачаточного или одноклеточного мицелия. Представляет интерес класс Phycomycetes, насчитывающий около 700 видов. Представители родов Mucor, Rhizopus, Thamnidium часто вызывают плесневение пищевых продуктов, образуя пушистый сероватый налет, некоторые виды используются в биотехнологии для синтеза ферментов.

К высшим грибам относятся дрожжи и плесневые грибы с многоклеточным мицелием. Отдел истинные грибы Eumycota включает 3 класса: Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes.

Ascomycetes – аскомицеты или сумчатые грибы, при половом размножении образуют споры внутри специальных сумок – асков; бесполое размножение – почкованием, конидиями. К аскомицетам относится род Saccharomyces, к которому принадлежат хлебопекарные, спиртовые, пивные, молочные дрожжи.

Basidiomycetes – базидиомицеты, имеют хорошо развитый септированный мицелий, бесполое размножение – конидиями, половое – базидиоспорами, к этому классу относятся макромицеты – съедобные и несъедобные шляпочные грибы, а также некоторые паразиты хлебных злаков.

Deuteromycetes – дейтеромицеты или несовершенные грибы (Fungi imperfecti), размножаются только бесполым путем (например конидиями, оидиями и др. экзоспосрами). Класс включает 2 порядка:

- протоасковые (в т.ч. неспорообразующие дрожжи);

- гифомицелиальные, в этот порядок входят 6 родов плесневых грибов, которые используются в биотехнологии и являются причиной возникновения пороков пищевых продуктов: Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Alternaria, Geotrichum, Catenularia.

 

12.2. Особенности строения и размножения мицелиальных грибов (плесеней).

Вегетативное тело плесеней состоит из гиф – разветвленных нитей диаметром 2-10 мкм. У многоклеточных плесеней гифы состоят из отельных клеток, разделенных перегородками-септами, тело одноклеточной плесени представляет собой одну гигантскую клетку со множеством ядер. Совокупность (сплетение) гиф образует мицелий (септированный и несептированный). Мицелий обычно не окрашен, цвет колонии (зеленый, черный, желтый и т.д.) придают споры.

Рост грибов осуществляется за счет кончиков гиф и может продолжаться до тех пор, пока хватает питательных веществ. Такой тип роста называется неограниченным.

Способы бесполого размножения плесеней разнообразны:

· хламидоспорами – уплотнение на гифе;

· конидиоспорами (круглой формы на специальных спороносных органах, характерны для родов Aspergillus и Penicillium);

· оидиями (деление гиф на овальные споры, так размножаются плесени рода Geotrichum, который раньше назывался Oidium);

· спорангиоспорами (овальные споры, формирующиеся в мешочках – спорангиях, род Mucor, Rhizopus, Thamnidium).

Способы полового размножения плесеней основаны на образовании особых видов спор: аскоспор, зигоспор, базиодиоспор. Процесс полового размножения плесеней разделяют на 3 фазы:

1.Плазмогамия – слияние двух протопластов (цитоплазм); новая клетка содержит 2 ядра и называется дикарион, ядра сливаются не сразу, может происходить цикл клеточных делений с сохранением двухядерных клеток.

2.Кариогамия - слияние гаплоидных ядер с образованием диплоидного ядра

3.Мейоз (редукционное деление, сопровождается уменьшением числа хромосом).

Например, при размножении аскоспорами мицелий сначала образует выросты – гаметангии. Один из них (F+) – антеридий, передает наследственную информацию, второй (F-) – аскогоний, принимает. В оплодотворенном аскогонии ядра не сливаются сразу, при делении образуются двухядерные гифы, затем ядра сливаются (кариогамия), происходит мейоз, образуется 8 аскоспор с гаплоидными ядрами. В дальнейшем аски превращаются в аскокарп или прорастают и образуют двухядерный или многоядерный мицелий.

Зигогамия (у мукора): образование на гифах утолщенных и обособленных участков (гаметангии), слияние гаметангий с последующим слиянием ядер и образованием зиготы, прорастание зиготы.

При созревании одного спороносного органа образуются сразу сотни спор, каждая из которых дает начало новой плесени, этим объясняется быстрое поражение продуктов. Для размножения плесеней оптимальными условиями являются температура 25-30°С и относительная влажность воздуха 70-80%, необходим доступ воздуха.

 

12.3. Особенности строения и размножения дрожжей.

Дрожжи – почкующиеся грибы (бесполое размножение – почкованием), относятся к классу аскомицетов, для которых характерно половое размножение аскоспорами (например, род Saccharomyces) или к дейтеромицетам (дрожжи, у которых нет способности к половому размножению, например, Torulopsis).

Форма клеток – шаровидная, яйцевидная, цилиндрическая, лимоновидная и т.п.

Классификация основана на способности к образованию асков, ложного мицелия и почкованию. Например, дрожжи рода Endomycopsis способны к образованию всех трех элементов, Saccharomyces - к образованию асков и почкованию, Candida - к образованию ложного мицелия и почкования, Torulopsis - только к почкованию.

Половое размножение дрожжей протекает следующим образом: диплоидная клетка претерпевает мейоз, в результате образуется 4 гаплоидных клетки двух типов – А и α; они могут делиться, образуя такие же гаплоидные клетки. При слиянии клеток двух типов образуется зигота, превращающаяся в нормальную диплоидную клетку; при слиянии однотипных получается анормальная клетка, не способная к мейозу.

Дрожжи широко распространены в природе (в почве, на поверхности растений, особенно плодов).

 

12. 4 Плесени и дрожжи в биотехнологии

Плесени используются в производстве пищевых продуктов: некоторых видов сыров (рокфор, голубые, во Франции – около 30 видов), соусов (вносят плесень в соевый белок), красного риса (национальные блюда), японской водки сакэ из рисового крахмала. Но чаще приносят вред: вызывают разнообразные пороки пищевых продуктов (прогоркание масла, «коричневая пуговица» в сгущенном молоке, плесневение хлеба), биотехнологических субстратов; некоторые виды могут вызывать заболевания растений (спорынья, фузариоз, черная гниль), животных и человека (отравления – микотоксикозы, «пьяная болезнь» от хлеба, грибковые поражения кожи и слизистых оболочек).

Некоторые виды плесеней используются в биотехнологии:

o Aspergillus niger – леечная плесень, черные конидии, применяется при получении лимонной, щавелевой кислот, глюкоамилазы, антибиотиков;

o Asp. оryzae – получение амилазы, фермента для гидролиза крахмала;

o Asp. alliaceus, Pen. fuscum – производство фосфоизомеразы;

o Penicillium notatum – зеленая кистевидная плесень, первый антибиотик пенициллинбыл получен Флемингом именно из этой плесени, сейчас с этой целью чаще используют генетически модифицированный вид Pen. chrysogenum;

o Pen. roqueforti, Pen. camamberti – в сыроделии.

Дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae используется человечеством с древних времен в хлебопечении, пивоварении, спиртовом производстве; аэробные, но способны сбраживать сахара в анаэробных условиях с образованием спирта и углекислого газа, путем аэрации этот процесс подавляют. В хлебопечении (в основном для ржаного хлеба) также используется другой вид этого рода -Sacch. minor.

Примеры применения других видов дрожжей в биотехнологии:

  • Sacch. lactis, Torulopsis kefiri входят в состав симбиотической кефирной закваски;
  • Sacch. vini – винные дрожжи, виноделие;
  • Kluyveromyces fragilis – получение этанола из молочной сыворотки;
  • Candida lipolitica – синтез лимонной, пировиноградной кислоты, получение кормового белка.
  • Kluyveromyces marxianus – синтез инвертазы.
  • Blakeslea trispora – продуцент ликопина, эргостерина

 

 

13.1. История развития вирусологии.

Болезни животных и растений, вызываемые вирусами, известны с глубокой древности. Эпидемии оспы, гриппа – испанки, полиомиелита, кори, свинки, ящура уносили миллионы жизней, опустошая города и страны. Но люди не знали причин эпидемий, и считали это наказанием богов.

Первооткрывателем вирусов считается русский ботаник Дмитрий Иванович Ивановский. В 1892 году, изучая мозаичную болезнь табака, он установил, что она вызывается возбудителем, который способен проходить через бактериальные фильтры, т.е. по размеру меньше бактерий.

Вирусами (от лат. слова вирус – яд) новые существа были впервые названы голландским микробиологом Бейеринком в 1899 году. Бейеринк впервые описал принципиальные различия между бактериями и вирусом табачной мозаики. Однако увидеть их было в то время невозможно – не позволяла разрешающая способность оптического микроскопа.

В конце 19 века было также обнаружено заразное (инфицирующее) действие фильтратов пораженных болезнями тканей животных, но ученые считали, что это токсин.

В 1915 году Творт описал стекловидные колонии микрококков, которые были поражены каким-то невидимым агентом (бактериофагом). Позже, в 1919 году, Д´Эрель подсчитал их частицы по бляшкам, которые появляются на колониях.

В 1933 году Шлезингер впервые наблюдал и подсчитал в темном поле частицы бактериофагов капустной палочки.

В 1941 Руска опубликовал первые снимки вирусов, сделанные с помощью электронного микроскопа. С этого времени вирусология как наука стала быстро развиваться.

В 50-е годы 20 века было изучено явление лизогении, а также было обнаружено, что фаги способны захватывать часть генетической информации бактериальной клетки. Это было в дальнейшем использовано в генетической инженерии.

В настоящее время изучены тысячи различных вирусов, особенно патогенных. Их даже научились использовать (в генетической инженерии как векторы – переносчики генов, в медицине – кишечный бактериофаг). Лечить вирусные заболевания трудно (обычно только симптоматически), антибиотики не действуют. Чем опасны? Вирус проникает в клетку, захватывает управляющие центры (ДНК) клетки и перестраивает ее работу на синтез нужных ему веществ – РНК, белков. У вируса простенькая программа, записанная в нескольких десятках генов, однако он способен заставить клетку работать на себя.

Вирусы способны размножаться в чужих клетках, но сами не имеют клеточного строения. Гипотезы о происхождении вирусов различны. Возможно, они являются результатом дегенерации прокариотической клетки. В то же время это пример биологического прогресса, т.к. такое упрощение в строении сопровождалось увеличением приспособленности и расширением ареала жизненного пространства: везде, где есть клетки, возможно существование вирусов.

 

13.2. Классификация и морфология вирусов.

Относятся к отдельному царству Vira (империя неклеточные).

В основе классификации: тип нуклеиновой кислоты (2 подцарства: рибовирусы и дезоксивирусы), ее молекулярная масса, процентное содержание, форма вирусной частицы, число структурных субъединиц в белковой оболочке, тип симметрии. В настоящее время вирусы делятся на 19 семейств (12 РНК, 7 ДНК).

Односпиральные РНК-вирусы (11 семейств): ретровирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы, рабдовирусы, тога-, бунья-, пикорна-, корона-, арена-, калици-, флави- вирусы.

Двуспиральная РНК: реовирусы.

Двуспиральная ДНК: покс-, герпес-, адено-, папова-, иридо-, гепадна- вирусы.

Односпиральные ДНК: парвовирусы.

Особенности морфологии вирусов: не имеют клеточного строения, очень малые размеры (от 20нм вирус полимиелита до 350 нм вирус оспы), облигатные внутриклеточные паразиты, не имеют собственных метаболических систем; содержат генетическую информацию, которую передают потомству (от 6 до нескольких сотен генов).

По форме вирусных частиц (вирионов) различают:

· шаровидные (вирус гриппа);

· кубоидальные (оспы);

· палочковидные (мозаичная болезнь табака, картофеля);

· сперматозоидные (многие бактериофаги);

· пулевидные (вирус бешенства);

· нитевидные (колифаги).

Общие принципы строения вирусов: в центре – нуклеиновая кислота, вокруг – оболочки. Первая – капсид, состоит из повторяющихся белковых субъединиц (капсомеров), располагающихся в определенном порядке, который определяет тип симметрии: спиральный, кубический, комбинированный. У сложных вирусов имеется вторая наружная оболочка (суперкапсид) с выступами-шипами.

Строение типичного бактериофага: шаровидная или икосаэдрическая головка с ДНК, покрытая капсомерами, и отросток, представляющий собой полый стержень, покрытый белковой оболочкой, заканчивающийся шипами и нитями, с помощью которых фаг прикрепляется к поверхности клетки.

 

13.3. Размножение вирусов.

Вирусы способны размножаться только в клетке организма-хозяина (облигатные внутриклеточные паразиты, высокоспецифичны). Различают вирусы - паразиты растений, животных, бактерий (бактериофаги, фаги).

Если фаги способны поражать только определенный штамм бактерий, их называют типовыми, только вид – монофагами, разные виды – полифагами.

Процесс репродукции вируса можно разделить на 6 стадий (плакат):

1. Стадия адсорбции – прикрепление вируса к поверхности восприимчивой клетки.

2. Стадия инъекции – вирус впрыскивает свою нуклеиновую кислоту (у фагов) или проникает сам и сбрасывает белковую оболочку (например, вирус гриппа).

3. Стадия репликации вирусной нуклеиновой кислоты – за счет нуклеотидов хозяина.

4. Стадия синтеза белков, специфичных для вируса (структурных и ферментов, в рибосомах хозяина)

5. Стадия сборки (самоорганизации) вирусов (образование комплексов НК и белков, оболочек, зрелых вирионов)

6. Стадия лизиса клетки – хозяина под действием ферментов фага.

Разрушение клетки-хозяина не всегда присходит сразу. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой:

- продуктивный (в зараженной клетке последовательно проходят все этапы, она разрушается, образуется новое поколение вирусов), такие вирусы называют агрессорами;

- интегративный (вирусная ДНК встраивается в хромосому клетки-хозяина и после редупликации передается новым клеткам, они становятся лизогенными), такие вирусы называются комменсалами (профаги или умеренные фаги), они не разрушают клетку сразу. При ослаблении клетки (механизм полностью не раскрыт) вирус приобретает агрессивность.

 

13.4. Бактериофагия в биотехнологической промышленности

Бактериофаги разрушают полезные микроорганизмы (заквасок, бакпрепаратов) в пищевой и биотехнологической промышленности.

Причина: высокая скорость размножения бактериофагов при благоприятных условиях (большое обсеменение сырья, сан-гигиеническое состояние производства), высокая устойчивость к действию температуры, рН, высушиванию.

Наиболее подвержены действию бактериофагов кокки, палочки более устойчивы, однако наблюдается опасная тенденция к полифагии. Фагорезистентность контролируется как основной ДНК, так и плазмидами, и может быть изменена

Косвенные показатели фаголизиса: внезапное прекращение нарастания кислотности, низкая кислотность субстрата, невыраженный вкус закваски или продукта.

Для борьбы с бактериофагами используют различные методы:

- подбор многовидовых и многоштаммовых заквасок (культур);

- постоянная ротация (замена) заквасок;

- создание фагорезистентных культур и заквасок с использованием методов генной инженерии (созданы коллекции бактериофагов, которые используются в селекционной работе при проведении тестов на фагорезистентность);

- соблюдение правил санитарии и гигиены, особенно мойки и дезинфекции оборудования, стен и т.п.

Обнаружение и идентификация – на основе обнаружения патогенного действия, образования внутриклеточных включений или бляшек на колониях. Так, например, в питьевой воде нормируется показатель наличия коли-фагов, измеряется в БОЕ – бляшкообразующих единицах.

Культивирование вирусов проводят на биологических объектах – в организме лабораторных животных, в куриных эмбрионах, в культурах клеток, в т.ч. бактериальных, или тканей.

Обнаружение и идентификация – на основе обнаружения патогенного действия, образования внутриклеточных включений или бляшек на колониях. Так, например, в питьевой воде нормируется показатель наличия коли-фагов, измеряется в БОЕ – бляшкообразующих единицах (зоны лизиса на колониях кишечной палочки).

 

 

14. Особенности метаболизма, размножение и культивирование микроорганизмов

 

14.1 Классификация микроорганизмов по типу питания

Микроорганизмы, как и все живые существа, в зависимости от источника углерода относятся к автотрофам или гетеротрофам.

В зависимости от источника энергии микроорганизмы делятся на фототрофы (используют энергию Солнца, например, цианобактерии) и хемотрофы (используют энергию химических реакций, например, серобактерии, нитрифицирующие, железобактерии).

В зависимости от источника электронов в энергетическом процессе микроорганизмы делятся на литотрофов (источник электронов – неторганические вещества) и органотрофов (органические вещества).

Таким образом, можно выделить 8 сочетаний типов энергетического и конструктивного метаболизма прокариот. Большинство изученных прокариот относится к группе хемоорганогетеротрофов, среди фотосинтезирующих – к группе с фотолитоавтотрофным питанием. Однако обнаружены и микроорганизмы с хемолитоавтотрофией (например, водородные бактерии), хемолитогетеротрофией (метанобразующие архебактерии), фотоорганоавтотрофией (некоторые пурпурные бактерии) и др. необычными путями метаболизма. Некоторые микроорганизмы способны использовать разные источники электронов или энергии.

Микроорганизмы- гетеротрофы делятся также на группы:

- сапрофиты (метатрофы), питающихся мертвой тканью животных и растений (например, Bacillus mesentericus – картофельная палочка);

- паразиты(паратрофы), которые живут за счет органики живых организмов (иногда являются возбудителями инфекционных заболеваний (например, Mycobacterium tuberculosis – туберкулезная палочка).

В зависимости от источника азота микроорганизмы также делятся на группы:

- аминоавтотрофы усваивают азот из неорганических веществ (азотфиксирующие почвенные клубеньковые бактерии; нитритно-нитратные – окисляют аммиак до солей азотистой и азотной кислот);

- аминогетеротрофы используют органические источники азота – дезаминирующие (усваивают только аминокислоты), пептонизирующие (только пептоны), протеолитические или гнилостные (расщепляют белки, способны выделять экзоферменты во внешнюю среду).

В зависимости от особенностей метаболизма выделяют также группу прототрофов – бактерий, способных синтезировать все соединения из глюкозы как единственного источника С и из солей аммония как единственного источника азота; все остальные – ауксотрофы.

 

14.2 Энергетические процессы у микроорганизмов. Виды брожений

Энергия нужна клетке для синтеза различных веществ, для осуществления движения и для поглощения веществ из окружающей среды (по механизму активного транспорта). Получение энергии обеспечивается процессами катаболизма – расщепления и окисления веществ, причем для микроорганизмов, как и для других живых существ, универсальным переносчиком энергии является АТФ.

Существуют два принципиально разных пути синтеза АТФ в клетке:

o субстратное фосфорилирование, реакции осуществляются в растворах;

o мембранное (окислительное или фото-) фосфорилирование – перенос электронов по электронтранспортной цепи (ЭТЦ), при этом субстраты окисляются постепенно, характерен для аэробных условий, синтез АТФ осуществляется на мембране.

Центральным амфиболитом считается глюкоза. Из трех известных путей первого этапа окисления глюкозы в пируват два - гликолиз и кетодезоксифосфоглюконатный путь - встречаются у микроорганизмов; третий, пентозофосфатный путь распространен у растений, а у микроорганизмов играет вспомогательную роль. Дальнейшее преобразование пирувата в ацетил-КоА у микроорганизмов может происходить по четырем различным механизмам, после чего ацетил-КоА поступает в окислительные циклы (прежде всего, цикл трикарбоновых кислот) или участвует в процессах брожений.

Брожением называют бескислородные превращения пирувата, при которых АТФ образуется в процессе анаэробного окисления органических субстратов в реакциях субстратного фосфорилирования.

Микроорганизмы могут вызывать разные виды брожений, например:

- молочнокислое гомоферментативное брожение (Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus), общее уровнение:

С6Н12О6 ® 2 С3Н6О3 (+2АТФ);

- спиртовое (дрожжи Saccharomyces cerevisiae)

С6Н12О6 ® 2 С2Н5ОН +2 СО2­ (+2АТФ);

- уксуснокислое, пропионовокислое, маслянокислое, ацетонобутиловое муравьинокислое и др.

Известны также типы гетероферментативных брожений, при которых набор конечных продуктов может быть различным как в качественном, так и в количественном отношении. Например, некоторые клостридии и энтеробактерии могут образовывать аетат, этанол, СО2 или лактат; бифидобактерии образуют лактат и ацетат; гетероферментативные лейконостоки – ацетат, фцетоин, этанол, СО2 и т.д.

14.3 Особенности размножения бактерий.

В результате поступления питательных веществ и процессов ассимиляции происходит увеличение массы и размеров микроорганизмов, т.е. их рост. Достигнув определенной фазы роста и зрелости, клетка начинает размножаться.

Бактерии размножаются путем равновеликого бинарного поперечного амитотического деления, в котором можно выделить 3 стадии:

Ø Редупликация – начинается в точке прикрепления кольцевой хромосомы к цитоплазматической мембране.

Ø Синтез мембраны в области контакта ДНК с мембраной → разделение, растаскивание молекул ДНК и оформление обособленных хромосом.

Ø Образование поперечной перегородки (септа у грам+, перетяжка у грам-) от периферии клетки к центру и разделение клетки на 2 дочерних.

Существуют и особые формы размножения, редко встречающиеся у бактерий: почкование, множественное деление у цианобактерий, образование экзоспор и фрагментация мицелия у актиномицет, образование плодовых тел и миксоспор у миксобактерий и др.

У бактерий известен также половой процесс – конъюгация, при которой наследственная информация в виде участка ДНК или плазмиды передается от одной клетки к другой.

Скорость размножения зависит от вида микроорганизма, возраста культуры, состава питательных сред, температуры, наличия кислорода, ростовых факторов и т.д. Время генерации кишечной палочки – 20-30 мин, нитрифицирующих – 5-10 ч, туберкулезной палочки – 18-24 ч.

Если бы клетки делились постоянно, то одна кишечная палочка в течение двух суток дала бы потомство, масса которого превысила бы массу земного шара. Однако этого не происходит. Что ограничивает размножение? Недостаток питательных веществ, образование токсичных метаболитов и др. факторы.

Рассмотрим закономерности размножения микроорганизмов в ограниченной объеме жидкой питательной среды, т.е. в статических условиях.

 

14.4 Закономерности развития микроорганизмов в статике (фазы роста)

Развитие микроорганизмов в статических условиях ограничено определенным объемом питательной среды. Закономерности характерны для периодического культивирования и могут быть отражены на графике зависимости логарифма количества клеток от времени культивирования. Выделяют 4 фазы роста:

1. Начальная фаза (лаг-фаза) – время приспособления (адаптации) микроорганизма к питательной среде, размножения клеток не наблюдается. Начинается синтез необходимых ферментов (механизм регуляции синтеза белка). Продолжительность фазы зависит от видовых особенностей, количества и возраста (активности ферментных систем) клеток, состава питательной среды, условий культивирования. Если активная культура попадает в такую же среду, лаг-фаза минимальная. Клетки обладают повышенной чувствительностью к внешним воздействиям.

2. Фаза логарифмического роста. Характерна максимальная скорость роста и размножения клеток; в культуре много молодых, биологически активных мко. Продолжительность зависит от количества питательных веществ, скорости накопления и токсичности продуктов метаболизма, аэрации для дрожжей. Устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды повышается.

Постепенно среда истощается, уменьшается количество доступных источников питания, накапливаются продукты обмена веществ. Для увеличения продолжительности этой фазы при непрерывном культивировании вводят новые порции питательной среды и удаляют часть клеток и продукты метаболизма.

3. Стационарная фаза – равновесие между числом образовавшихся и погибших клеток. Устойчивость клеток высокая. Скорость размножения снижается. При культивировании заквасок – фаза урожая. В дрожжевом производстве – дозревание клеток. Растет концентрация токсичных продуктов обмена.

3. Фаза отмирания – прекращение роста и размножения, уменьшение количества живых клеток, появление деградированных (больных) форм, формируются споры, накапливаются вторичные продукты метаболизма. Фаза может длиться несколько недель или месяцев, культура погибает.

 

14.5 Сущность и виды культивирования микроорганизмов

Культивирование – выращивание микроорганизмов на специальных питательных средах. Культивирование проводят в лабораторных и производственных условиях с целью:

- количественного и качественного анализа микрофлоры различных объектов: пищевых продуктов, воды, воздуха и т.д.;

- изучения свойств микроорганизмов и их идентификации;

- выращивания полезных микроорганизмов (приготовление заквасок, получение продуктов микробиологического синтеза, ферментов, белка и т.д.).

Питательные среды должны содержать все питательные вещества, макро- и микроэлементы, необходимые для развития данного вида (или группы видов) микроорганизмов, а также иметь оптимальные значения активной кислотности и окислительно-восстановительного потенциала. К обязательным компонентам относятся: вода, биогенные элементы (С, Н, О, N, Р, S), для большинства микроорганизмов необходимы также К, Са, Fe, Mg, для некоторых требуются микроэлементы (Со, Ni, Zn), витамины и др. ростовые факторы. Закономерности роста на разных питательных средах определяют культуральные свойства и являются видовым признаком.

На плотных питательных средах микроорганизмы образуют колонии – популяции микробных клеток, между которыми существуют связи за счет прилипания (когезии) или специальных образований – тяжей. Это своего рода саморегулирующаяся многоклеточная система. Колонии очень разнообразны по форме, цвету, размерам и т.д., их описание используется при идентификации микроорганизмов.

Различают три вида культивирования микроорганизмов:

1. Периодическое – используется при получении заквасок; характерны закономерности статической культуры до фазы отмирания, включает стадии выращивания, концентрирования клеток путем отделения от питательной среды сепарированием, сублимационной сушки, для которой используются специальные защитные среды.

2. Непрерывное,целью которого является продление фазы роста, для этого используют два способа – многократный пересев на новую питательную среду и непрерывное введение питательного раствора при одновременном удалении продуктов метаболизма и части бактериальной суспензии. Осуществляют в специальных аппаратах двух типов: хемостатах (рост микроорганизмов регулируется концентрацией лимитирующих веществ питательного субстрата – источников С, азота, витаминами, микроэлементами и т.п.) или в турбидостатах (процесс контролируется по изменению концентрации микроорганизмы путем измерения оптической плотности, мутности в прозрачных питательных средах).

3. Синхронное –одновременное деление клеток, применяется в научных целях для изучения циклов клеточного деления; нужны клетки одного возраста, этого добиваются путем изменения температуры, поступления кислорода, питательных веществ, использования бактериальных фильтров.

14.6 Метаболические процессы как основа биотехнологических производств.

Микробный синтез – многоступенчатый процесс получения какого-либо полезного вещества на основе использования микроорганизмов, в котором участвует большое количество ферментов (молочная и др. кислоты, антибиотики, аминокислоты). Отличием микробной трансформации является участие одного фермента, катализирующего специфическую реакцию (получение стероидов, гормонов, окисление глюкозы в глюконовую кислоту).

Различают также синтез:

- первичных метаболитов – низкомолекулярные органические вещества, служат материалом для построения макромолекул или коферментов: аминокислоты, нуклеотиды, витамины, органические кислоты (самые большие объемы производства в мире уксусной и молочной кислоты), спирты;

- вторичных метаболитов – веществ, образующихся на поздних фазах развития культуры, когда истощается среда и накапливаются первичные метаболиты: антибиотики, токсины, пигменты. Если патогенные микроорганизмы выделяют токсины при жизни во внешнюю среду – экзотоксины, если токсины образуются внутри клетки – эндотоксины. Способность к синтезу пигментов – видовой признак, защита от облучения (желтые колонии сарцин, розовые микрококков, красные колонии образуют некоторые дрожжи, чудесная палочка, сине-зеленые – синегнойная палочка). По сути, вторичные метаболиты – это вещества, использующиеся клеткой для выживания в неблагоприятых условиях.

15. Влияние факторов внешней среды на развитие микроорганизмов

15.1 Влияние температуры

Температураокружающей среды – один из наиболее важных факторов, т.к. сами микроорганизмы не способны ее регулировать.

Область температур, в которой идут биохимические реакции, называется биокинетической зоной (от –2 до 100°С). Гибель микроорганизмов за пределами биозоны наступает в результате инактивации ферментов, РНК, повреждения цитоплазматической мембраны.

Низкие температуры микроорганизмы выдерживают легче, т.к. наблюдается не гибель, а замедление роста и размножения, у некоторых микроорганизмов жизнеспособность даже вегетативных форм сохраняется после охлаждения до –250°С в течение нескольких суток, а споровые в вечной мерзлоте сохраняют жизнь тысячелетиями. Условие – отсутствие механического повреждения кристаллами льда. На этом основан щадящий способ получения сухих заквасок – сублимационный или лиофильный (путем вымораживания воды).

По отношению к температуре микроорганизмы делят на три группы – психрофилы, мезофилы и термофилы.

1. Психрофилы (криофилы, холодолюбивые) развиваются при низких температурах, бывают:

- облигатные (строгие) – мах (максимальная температура развития) 20¸25°С, оптимум (оптимальная температура) 10¸15°С, мин (минимальная температура развития) 0 ¸ -18°С;

- факультативные – мах 30¸37°С, опт 20°С, мин 0¸ -18°С.

Можно выделить из вод северных морей, ледников, холодильных камер. Вызывают порчу молочных продуктов, например, Pseudomonas fluorescens – флуоресцирующая палочка. Некоторые могут образовывать токсины и вызывать пищевые отравления (например, Listeria monocytogenes).

2. Мезофилы – любят средние температуры; мах 40¸45°С, опт 25¸37°С, мин 5¸10°С. К мезофилам относятся многие виды заквасочной микрофлоры (например, Lactococcus cremoris, Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae), некоторые являются возбудителями заболеваний человека и животных (Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae).

3. Термофилы(теплолюбивые), различают несколько разновидностей:

- факультативные мах 50¸65°С, опт 45¸50°С, мин 18¸20°С (к ним относятся молочнокислые термобактерии, например, Lactobacillus acidophilus);

- облигатные – мах 70¸90°С, опт 65¸70°С, мин 40°С (могут развиваться в вакуум-выпарных аппаратах);

- стенотермные, термофилы-экстремалы, выдерживают 100°С, выделены из горячих источников, относятся к категории археобактерий;

- термотолерантные выдерживают 50¸60°С, но лучше развиваются при 35-40°С.

Для каждого вида микроорганизмов могут быть определены следующие характеристики:

· точка термической гибели – наиболее низкая температура, при которой микроорганизмы погибают за 10 мин;

· время термической гибели – время, в течение которого погибают все микроорганизмы данного вида при определенной температуре.

Эти характеристики зависят от состава питательной среды, осмотического давления, количества и возраста клеток. На основе изучения влияния температуры на развитие микроорганизмов разработаны режимы пастеризации и стерилизации. Цель стерилизации – уничтожение микроорганизмов как в вегетативной, так и в споровой форме, при пастеризации уничтожаются только вегетативные клетки.

 

15.2. Влияние влажности и осмотического давления.

Микробная клетка на 70-85% состоит из воды, все питательные вещества попадают в клетку только в растворенном виде, поэтому активность воды – один из важнейших абиотических факторов. По потребности в воде микроорганизмы подразделяют на три группы: гидрофиты (влаголюбивые), мезофиты (средние потребности) и ксерофиты (минимально потребляющие воду).

Нормальное состояние (тургор) клетки характеризуется определенной величиной осмотического давления, которое зависит от концентрации растворенных веществ, прежде всего минеральных солей и моносахаров.

При повышении осмотического давления в окружающей среде (гипертонический раствор) клетка обезвоживается, цитоплазматическая мембрана отходит от цитоплазмы, клетка погибает в результате плазмолиза. На этом явлении основаны многие способы консервирования пищевых продуктов и биологических объектов.

Существуют микроорганизмы, которые выдерживают повышенное осмотическое давление – осмофилы. Различают солелюбивые (галофилы) и сахаролюбивые осмофилы. Экстремальные галофилы выдерживают концентрацию соли до 32%. К умеренным осмофилам относятся многие виды плесеней, дрожжей, микрококков, которые могут вызывать пороки сгущенных молочных консервов.

При снижении осмотического давления (гипотонический раствор) клетка впитывает избыточное количество влаги и тоже может погибнуть, это явление плазмоптиза.

 

15.3. Влияние реакции среды и химических веществ

Большинство микроорганизмов относятся к нейтрофилам, которые предпочитают среды, близкие к нейтральным в диапазоне рН 7,0±1,0, и погибают при рН менее 4,5 и более 9. Концентрация ионов водорода воздействует на ионное состояние и, следовательно, на доступность для клетки многих метаболитов.

Существуют микроорганизмы, которые любят кислую среду (рН от 0 до 5,5) – ацидофилы, например Lb. аcidophilus. Как правило, ацидофилы сами способны вырабатывать кислоты (например, молочную, уксусную и др.). Экстремальные ацидофилы или кислотоустойчивые бактерии выдерживают рН=1.

Микроорганизмы, которые лучше развиваются в щелочных средах (рН от 8,5 до 11,5) называются алкалофилами. К ним относятся протеолитические микробы, разлагающие белок с образованием щелочных продуктов, они плохо выдерживают кислую среду (например, Proteus vulgaris, все Bacillus subtilis). Это свойство используется при консервировании (маринады), производстве кисломолочных продуктов, которые могут храниться длительное время.

Некоторые химические вещества могут быть неблагоприятны для микроорганизмов, останавливая их рост (бактериостатический эффект) или вызывая гибель (бактерицидный эффект). Например:

- поверхностно-активные (мыла, жирные кислоты);

- фенол, крезол и производные – действуют на клеточную стенку и белки цитоплазмы;

- акридины нарушают процесс деления клеток;

- формальдегид и соли тяжелых металлов вызывают денатурацию белков.

Это явление используется в медицине и пищевой промышленности для дезинфекции инструментов и оборудования.

15.4 Влияние кислорода

Важную роль в энергетических процессах играет кислород. По отношению к молекулярному кислороду микробов делят на аэробов, анаэробов и факультативных анаэробов.

Аэробамдля метаболизманеобходим кислород, они хорошо растут в его присутствии, образуя колонии на поверхности плотных питательных сред (Sarcina flava, Bacillus subtilis). Аэробы могут быть растущими на воздухе и микроаэрофильными (растут при низких концентрациях кислорода).

Анаэробы,которым кислород не нужен для процессов метаболизма, делятся на:

o строгих, которые гибнут в присутствии кислорода, для их культивирования используют специальные питательные среды (Clostridium botulinum),

o факультативных(способных переключаться с анаэробного пути окисления на аэробное), образуют глубинные колонии на плотных питательных средах (например, молочнокислые бактерии)

o аэротолерантных (терпимых к присутствию кислорода).

 

15.5. Влияние излучения, ультразвука, электричества и магнитного поля

Видимое излучение (солнечный свет) некоторые микроорганизмы способны использовать (например, фотосинтезирующие бактерии), для большинства солнечные лучи губительны, в т.ч. для патогенных микробов. Наиболее эффективны коротковолновые УФ лучи, т.к. поглощаются нуклеиновыми кислотами и белками, вызывают мутации, инактивацию ферментов, оказывают влияние на метаболизм. Наиболее устойчивы пигментообразующие микроорганизмы. Некоторые бактерии способны приобретать устойчивость при облучении.

Ультразвуквызывает механическое повреждение и разрушение клеток, больше влияет на палочковидные микроорганизмы.

Электричество оказывает действие через электромагнитные процессы в среде и клетке, УВЧ-токи – благодаря тепловому воздействию (колебание диполей воды).

Магнитное поле влияет на магниточувствительные микроорганизмы, по-видимому через белки-ферменты, содержащие атомы железа; установлено влияние геомагнитной обстановки на вспышки инфекционных заболеваний.

Гидростатические давление более 110 МПа вызывает денатурацию белков, инактивацию ферментов и гибель микроорганизмов, однако на дне океанов обнаружены барофильные глубоководные археобактерии.

Невесомость замедляет рост колоний, возможно, нарушается контакт между клетками.

! Физико-химические факторы взаимосвязаны между собой. Так, например, действие химических веществ зависит от температуры, рН, осмотического давления и т.д.

 

15.6 Виды взаимоотношений между микроорганизмами

Основные типы взаимоотношений: симбиоз - позитивные, антибиоз или антагонизм - негативные, нейтрализм – безразличные, индифферентные.

Рассмотрим примеры симбиотических взаимоотношений между микроорганизмами.

Мутуализм – идеальный симбиоз (например, кефирный грибок – это симбиоз молочнокислых, уксуснокислых бактерий и дрожжей, который пока не может быть создан искусственно).

Комменсализм – один получает пользу, второму безразлично (например, кишечная палочка в теплокровном организме).

Метабиоз – специфический вид симбиоза, при котором один вид микроорганизмов продолжает процесс, вызванный другим (например, сожительство аммонитрификаторов, окисляющих белки до токсичного аммиака, и нитрификаторов, окисляющих его до безопасных веществ).

Сателлизм – стимуляция роста одного микроорганизма продуктами жизнедеятельности другого (дрожжи вырабатывают витамины группы В, которые ускоряют рост молочнокислых бактерий).

Синергизм – усиление физиологических функций в сообществе (сочетание молочнокислых микроорганизмов-кислотообразователей и ароматообразователей в заквасках).

Антагонистические взаимоотношения в мире микробов также могут проявляться по-разному:

- паразитизм (бактериофагия);

- продукты жизнедеятельности одного микроорганизмы губительно действуют на другие микроорганизмы (молочнокислые бактерии подавляют гнилостную микрофлору);

- истощение питательного субстрата микроорганизмом, который развивается быстрее (культурные и дикие дрожжи в хлебопечении);

- выделение антибиотических веществ.

 

15.7 Виды и механизмы действия антибиотиков

Антибиотики– специфические соединения (вторичные метаболиты клетки), способные в незначительных количествах избирательно задерживать рост или убивать микроорганизмы.

Термин введен Ваксманом в 1942 году. Важное свойствао – специфичность, избирательность действия только на определенные, чувствительные виды микроорганизмов. Описано более 5 тысяч, на практике применяется около 100 (основное требование - максимальная безвредность для макроорганизма).

Антагонистическое действие некоторых микроорганизмов было замечено давно и применялось в народной медицине (плесени – для лечения ран, кисломолочные для лечения кишечных заболеваний и туберкулеза). Роль ученого-первооткрывателя антибиотиков принадлежит Александру Флемингу – английскому ученому-бактериологу (1881-1955). Он заметил, что в чашках Петри вокруг разросшихся колоний плесеней появились участки, очищенные от стафилококковых колоний. Флеминг пересеял пенициллиновую плесень в жидкую среду и выделил вещество, подавляющее стафилококки – пенициллин.

Первый пенициллин был нестойким, быстро терял свойства, был дорогим из-за сложной очистки. Только после того как методами направленной селекции удалось получить штаммы, продуцирующие в десятки тысяч раз больше антибиотических веществ, чем природные штаммы, производство и применение антибиотиков приобрело широкие масштабы. Сейчас ученые вынуждены постоянно работать над получением новых антибиотиков, т.к. патогенные микроорганизмы обладают способностью к приобретению антибиотикоустойчивости.

По происхождению антибиотики делятся на:

- продуцируемые актиномицетами (стрептомицин, тетрациклин, неомицин, нистатин и др), активны в отношении грам+ бактерий (возбудителей туберкулеза, брюшного тифа, бруцеллеза, сальмонеллеза и др.);

- продуцируемые плесневыми грибами (пенициллиновые – действуют на грам+ стафилококки и стрептококки);

- продуцируемые бактериями (грамицидин, субтилин, низин), подавляют развитие кишечных палочек, стафилококков, маслянокислых бактерий;

- животного происхождения (лизоцим, эритрин из эритроцитов, экмолин из тканей рыб);

- растительного происхождения (фитонциды лука, чеснока, крапивы и др.)

Бывают также полусинтетические (полученные биопутем, но подвергнутые химической модификации) и синтетические антибиотики.

По механизму биологического действия условно подразделяют на:

- ингибирующие синтез клеточной стенки (пенициллин);

- нарушающие функции мембран (грамицидин, нистатин);

- подавляющие синтез НК (канамицин, неомицин);

- ингибиторы процессов дыхания.

Эффективность действия антибиотика зависит от следующих факторов:

- природы (происхождения, механизма действия) антибиотика;

- концентрации и времени действия антибиотика;

- свойств клетки;

- внешних условий (температуры, рН и др).

 

15. 8 Биологические принципы консервирования.

Знания о влиянии факторов внешней среды используются для регулирования жизнедеятельности микроорганизмов при производстве и хранении продуктов (субстратов) в биотехнологической промышленности.

Выделяют 3 биологические принципа консервирования:

Биоз – поддержание в продукте или сырье жизненных процессов, препятствующих развитию микроорганизмы, а также использование естественного иммунитета сырья (бактерицидная фаза молока).

Анабиоз – подавление биологических процессов; различают несколько видов:

- термоанабиоз – охлаждение (психроанабиоз) и замораживание (криоанабиоз);

- ксероанабиоз (удаление влаги, высушивание),

- осмоанабиоз (создание высоких концентраций осмотически активных веществ),

- наркоанабиоз (фасовка и хранение в среде газов – кислорода, азота, углекислого газа),

- ценоанабиоз (введение полезных микроорганизмы, подавляющих развитие вредных).

Абиоз – полное прекращение жизненных процессов, достигается путем стерилизации.

 

 

16. Генетика и селекция микроорганизмов

 

16.1 История изучения изменчивости микроорганизмов.

Начало серьезного изучения изменчивости микроорганизмов относится ко второй половине 19 века. В это время формировались два противоположных направления:

- полиморфизм – отрицание постоянства формы бактерий, существует только несколько видов, которые подвержены постоянным изменениям морфологических, культуральных, биохимических свойств в зависимости от условий; отрицание возможности систематики микроорганизмов;

- мономорфизм (связан с разработкой методов выделения чистых культур на плотных питательных средах) – отрицание изменчивости свойств микробов, созданы основы классификации микроорганизмов.

Современные научные представления: в природе существует множество видов микроорганизмов, обладающих определенными биологическими свойствами, которые передаются по наследству и могут изменяться под влиянием физических, химических и биологических факторов внешней среды.

 

16.2 Виды и формы изменчивости микроорганизмов

Как и у других живых организмов, изменчивость микробов может быть фенотипической и генотипической, в т.ч. мутационной и комбинативной.

Генотипическая комбинативная изменчивость связана с рекомбинацией генов, при этом меняется характер их взаимодействия, в результате меняются признаки. У прокариот известны особые виды комбинативной изменчивости – трансформация, трансдукция, коньюгация.

Трансформация – перенос участка ДНК от клетки донора к клетке-реципиенту. Условие – клетка-донор разрушена.

Явление открыто в 1928 году Гриффитом. Английский микробиолог наблюдал изменения наследственного признака у пневмококков Diplococcus pneumoniae. У этого вида имеются несколько штаммов, отличающихся формой колоний (S и R) и вирулентностью. Штамм S вызывает гибель животных от пневмонии, штамм R – не вызывает. Гриффит заражал мышей смесью R-штамма и убитых нагреванием бактерий S-штамма, при этом мыши заболевали и погибали, а среди выделенных клеток были обнаружены S-штаммы, т.е. произошло превращение некоторых бактерий R-штамма в вирулентные. В 1944 году американский микробиолог Эйвери повторил эксперимент, но на другом уровне: выделил из S-штамма ДНК, внес ее в культуру с R-штаммом и показал, что переносчиком информации о вирулентности является ДНК. Так было получено одно из доказательств того, что ДНК – материал наследственности и изменчивости.

Путем трансформации может быть изменена болезнетворность микробов, чувствительность к антибиотикам, способность к синтезу ферментов и другие признаки.

Трансдукция – перенос генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту умеренным фагом.

Явление открыто в 1952 году Циндлером и Ледербергом. Объект - тифозные бактерии Salmonella typhimurium. В У-образную трубку, разделенную бактериальным фильтром, были помещены 2 штамма бактерий – один (2А) способен синтезировать триптофан, второй (22А) – не способен. В среду был внесен бактериофаг, после чего некоторые клетки 22А приобрели способность к синтезу этой аминокислоты. Так было доказано, что бактериофаги могут являться переносчиками наследственной информации.

Конъюгация – форма полового процесса между микроорганизмами, при котором происходит передача ядерного вещества (участка хромосомной ДНК или чаще плазмиды).

У некоторых микроорганизмов в процессе конъюгации большую роль играют F-пили. Клетки, выполняющие роль донора, называют F+ (F - фактор фертильности), реципиента – F-.

Явление коньюгации открыто в 1946 году Ледербергом и Тейтумом, которые проводили эксперименты с мутантами кишечной палочки E.coli. Теоретически вероятность мутации генов, приводящей к способности синтезировать 4 аминокислоты была равна 10-14, а в опыте получали частоту 10-6. Было установлено, что необходимым элементом рекомбинации служит прямой контакт родительских клеток, т.е. конъюгация. В дальнейшем это было подтверждено с помощью электронной микроскопии.

Биологическое значение конъюгации стало ясно после внедрения в практику антибиотиков. Устойчивость к антибиотикам, приобретенная даже одной выжившей клеткой, способна быстро распространяться среди других бактерий путем конъюгации.

Изменчивость может касаться разных свойств микроорганизмов (формы изменчивости):

- морфологических - например, меняется форма клетки (плеоморфизм);

- культуральных - на плотных питательных средах некоторые микроорганизмы могут образовывать колонии разной формы, например:

· S-формы с гладкими, ровными краями, прозрачные;

· R – формы шероховатые, непрозрачные со складчатой поверхностью и ворсинчатым краем;

· М-форма – слизистая; у патогенных наиболее болезнетворной (вирулентной) является S-форма;

- биологических, например, болезнетворность снижается при воздействии температуры, высушивания, химических веществ, это используется для приготовления вакцин;

- отношение к антибиотикам – могут появляться устойчивые штаммы, больше всего таких штаммов в больницах;

- способность к синтезу ферментов, потребности в определенных факторах роста и др.

 

 

Цель селекции – отбор организмов с улучшенными промышленно-ценными свойствами.

Микроорганизмы как объекты селекции имеют ряд особенностей:

Ø быстрая смена поколений, следовательно, ученые имеют больше возможностей для отбора;

Ø большое количество генотипически однородного материала также расширяют возможности науки, но выделение отдельных изменившихся клеток - очень трудоемкий процесс;

Ø отсутствует половое размножение, поэтому не применимы известные методы селекции высших организмов (скрещивание, гибридизация).

Этапы селекции:

1. Выбор объекта. Для селекции используют микроорганизмы из коллекционных (музейных) культур, известные промышленные продуценты, выделенные из природных субстратов с учетом того, что хотим получить. Крупные коллекции микроорганизмов: NCDO (National Collection of Dairy Organisms), VKPM (ВКПМ – Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов), ATCC (American Type Culture Collection)

2. Мутагенез (индуцированный с помощью физических или химических факторов) или рекомбиногенез – слияние клеток (у эукариот), генная инженерия, конъюгация, трансформация, трансдукция.

4. Отбор – естественный (например, выдерживают повышенную кислотность, остаются наиболее кислотоустойчивые) или искусственный (ряд специальных методов, основанных на знании биохимии и физиологии)

5. Стабилизация свойств полученных штаммов.

6. Консервация (в замороженном состоянии, в песке, под слоем масла и др.)

 

Цель генетической инженерии: получить организмы с улучшенными или принципиально новыми свойствами. Значимые результаты были получены при работе с микроорганизмами. Например, в настоящее время организовано промышленное производство инсулина и интерферона, синтезируемых генетически модифицированной кишечной палочкой.

Основные этапы:

1. Получение необходимых генов путем вырезания фрагментов известного генома, с помощью биосинтез или химического синтеза.

2. Включение гена в вектор–переносчик, в качестве которого могут использоваться плазмиды, фаги, космиды (объединение фрагмента ДНК бактериофага и плазмид).

3. Ввод вектора в геном клетки-хозяина (осуществляется путем трансформации, трансдукции и др.)

4. Отбор бактерий с новым геном, закрепление новых свойств.

5.

 

16.4 Структура и функции оперона – генетической системы регуляции синтеза белка у бактерий

В ДНК содержится информация обо всех ферментах, которые вообще может синтезировать данная клетка. Для исключения лишних затрат энергии в клетке должен идти синтез только тех ферментов, которые ей необходимы в данный момент времени, в определенных условиях внешней среды.

Основой регуляции процессов синтеза белка является оперон – комплекс генов, включающий:

- ген-регулятор (Р), обеспечивающий синтез белка-репрессора (РЕП);

- ген-оператор (О), управляет включением и выключением считывания информации со структурных генов, способен взаимодействовать с белком-репрессором;

- ген-промотор (П) – место прикрепления РНК-полимеразы – фермента, осуществляющего процесс транскрипции;

- структурные гены (СГ, содержат информацию о последовательности аминокислот в ферментах).

Механизм функционирования системы регуляции синтеза белка был открыт в 1962 году Жакобом и Моно при исследовании культивирования кишечной палочки в лактозной среде и назван lac-опероном.

Упрощенно этот механизм может быть описан следующим образом. На основе информации гена-регулятора синтезируется белок-репрессор; если он активный, он связывается с геном-оператором, перекрывая путь для РНК-полимеразы – процесс трансляции и последующего синтеза белка выключается (запрещается). Если появляется индуктор (например, лактоза в lac-опероне), он присоединяется с белку-репрессору, приводя его в неактивное состояние. Оператор становится активным и включает процесс считывания информации со структурных генов – разрешает трансляцию. Происходит считывание информации с ДНК, начинается синтез необходимого белка – фермента (например, β-галактозидазы в lac-опероне).

Это только один из возможных механизмов, который называется запрещающей индукцией. Существуют и другие механизмы регуляции синтеза белка: разрешающая индукция, разрешающая и запрещающая репрессия, в которых принимают участие апоиндукторы и корепрессоры.

 

 

17. Экология микроорганизмов

 

17.1 Функции микроорганизмов в природе

Микроорганизмы – живые существа, наиболее широко распространенные в природе и играющие огромную роль в круговороте веществ. Основными функциями микроорганизмов в природных местообитаниях являются следующие:

· минерализация, т.е. разрушение органических субстратов до СО2, NH3, H2, СН4, Н2О;

· поставка питательных веществ (в виде метаболитов, полисахаридов) для других хемогетеротрофных микро- и макроорганизмов, т.е. участие в пищевых цепях

· модификация сложных соединений в форму, доступную для других организмов;

· выделение соединений, подавляющих активность других микроорганизмов или ограничивающих выживание и функционирование макроорганизмов.

 

17.2. Микрофлора почвы.

Микроорганизмы играют огромную роль в формировании почвы с древних времен и по наше время. В 1 г чернозема содержится от десятков млн. до нескольких млрд. микробных клеток. Больше всего их в поверхностных слоях почвы (10-20 см) – богаты органикой, насыщены кислородом; но обнаружены и на очень больших глубинах – до 200 м. На количество и видовое разнообразие микрофлора влияет минеральный состав почв, время года, влажность, загрязненность сточными водами и др. факторы.

Основные представители:

- цианобактерии (в основном сине-зеленые водоросли) – используют солнечную энергию для синтеза органики из СО2 и Н2О, в глубине могут вести себя как гетеротрофы;

- грибы - плесневых больше, чем дрожжей, в основном пенициллиновые, мукоровые и аспергилловые; любят кислые, богатые органикой почвы;

- актиномицеты (лучистые грибки, по строению клетки относятся к прокариотам, но имеют ветвящиеся формы и мицелий, напоминающий плесени) – самые активные разрушители органики, устойчивы к неблагоприятным условиям, до 30% всей микрофлора почвы;

- бактерии (гетеротрофы) – очень разнообразные, тысячи видов, обязательные звенья в цепи круговоротов азота, углерода, серы, фосфора, железа и др.; часто высеваются спорообразующие, гнилостные сапрофитные, но присутствуют и патогенные – возбудители столбняка, ботулизма, сибирской язвы.

Бактерии имеют тенденцию присутствовать в виде микроколоний на поверхности почвенных частиц или в виде суспензии в почвенном растворе в порах. Нитчатые грибы и мицелиальные формы прокариот способны расти как на почвенных частицах, так и между ними, оплетая их. Простейшие обитают в водной пленке и поедают бактерии.

О санитарном состоянии почв судят по содержанию бактерий группы кишечной палочки (БГКП, показатель загрязнения фекальными сточными водами) и термофилов. В процессе разложения органических остатков происходит смена микробных ассоциаций и самоочищение почвы (снижается БГКП, патогенных), но нужно время.