БИОТЕХНОЛОГИИ

Тема 2. БИОСИСТЕМЫ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ В

Одним из терминов в биотехнологии является понятие «биосистемы». Обобщенные характеристики биологической (живой) системы могут быть сведены к трем присущим им основным признакам:

1. Живые системы являются гетерогенными открытыми системами, которыми обмениваются с окружающей средой веществами и энергией.

2. Эти системы являются самоуправляемыми, саморегулирующими, идактивными, т.е. способными к обмену информацией с окружающей средой для поддержания своей структуры и управления процессами метаболизма.

3. Живые системы являются самовоспроизводящимися (клетки, организмы).

По структуре биосистемы делятся на элементы (подсистемы), связанные между собой, и характеризуются сложной организацией (атомы, молекулы, органеллы, клетки, организмы, популяции, сообщества).

Управление в клетке представляет собой сочетание процессов синтеза молекул белков-ферментов, необходимых для осуществления той или иной функции, и непрерывных процессов изменения активности в ходе взаимодействия триплетных кодов ДНК в ядре и макромолекул в рибосомах. Усиление и торможение ферментативной активности происходит в зависимости от количества начальных и конечных продуктов соответствующих биохимических реакций. Благодаря этой сложной организации биосистемы отличаются от всех неживых объектов.

Поведение биосистемы является совокупностью ее реакций в ответ на внешние воздействия, т.е. наиболее общей задачей управляющих систем живых организмов является сохранение его энергетической основы при изменяющихся условиях внешней среды.

Н.М. Амосов делит все биосистемы на пять иерархических уровней сложности: одноклеточные организмы, многоклеточные организмы, популяции, биогеоценоз и биосферу.

Одноклеточные организмы – это бактерии и простейшие. Функции одноклеточных – обмен веществом и энергией со средой, рост и деление, реакции на внешние раздражители в виде изменения обмена и формы движения. Все функции одноклеточных поддерживаются за счет биохимических процессов ферментативной природы и за счет энергетического обмена – начиная от способа получения энергии и до синтеза новых структур или расщепления существующих. Единственным механизмом одноклеточных, обеспечивающим их приспособление к окружающей среде, является механизм изменений в отдельных генах ДНК и, как следствие, изменение белков-ферментов и изменение биохимических реакций.

Основной системой подхода к анализу структур биосистем является ее представление в виде двух компонентов – энергетической и управляющей.

Структура биосистем поддерживается механизмами генетического управления. Получая от остальных систем энергию и информацию в виде продуктов обмена веществ (метаболитов), а в период формирования – в виде гормонов, генетическая система управляет процессом синтеза необходимых веществ и поддерживает жизнедеятельность остальных систем организма, причем процессы в этой системе протекают достаточно медленно.

Несмотря на многообразие биосистем, отношения между их биологическими свойствами остаются инвариантными для всех организмов. В сложной системе возможности к адаптации значительно больше, чем в простой. В простой системе эти функции обеспечиваются малым количеством механизмов, при этом они более чувствительны к изменениям во внешней среде.

Для биосистем характерна качественная неоднородность, проявляющаяся в том, что в рамках одной и той же функциональной биосистемы совместно и слаженно работают подсистемы с качественно различными адекватными управляющими сигналами (химическими, физическими, информационными).

Иерархичность биосистем проявляется в постепенном усложнении функции на одном уровне иерархии и скачкообразном переходе к качественно другой функции на следующем уровне иерархии, а также в специфическом построении различных биосистем, их анализа и управления в такой последовательности, что итоговая выходная функция нижележащего уровня иерархии входит в качестве элемента в вышележащий уровень.

Постоянное приспособление к среде и эволюция невозможны без единства двух противоположных свойств: структурно-функциональной организованности и структурно-функциональной вероятности, стохастичности и изменчивости.

Структурно-функциональная организованность проявляется на всех уровнях биосистем и характеризуется высокой устойчивостью биологического вида и его формы. На уровне макромолекул это свойство обеспечивается репликацией макромолекул, на уровне клетки – делением, на уровне особи и популяции – воспроизведением особей путем размножения.

В качестве биологических объектов или систем, которые использует биотехнология, прежде всего необходимо назвать одноклеточные микроорганизмы, а также животные и растительные клетка. Выбор этих объектов обусловлен следующими моментами:

1. Клетки являются своего рода «биофабриками», вырабатывающими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продукты: белки, жиры, углеводы, витамины, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и пр. Многие из этих продуктов, крайне необходимы в жизни человека, пока недоступны для получения «небиотехническими» способами из-за дефицитности или высокой стоимости сырья или же сложности технологических процессов.

2. Клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся. Так, бактериальная клетка делится через каждые 20-60 минут, дрожжевая - через каждые 1,5-2 ч, животная – через 24 ч, что позволяет за относительно короткое время искусственно нарастить на сравнительно дешевых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, животных или растительных клеток. Например, в биореакторе емкостью 100 м³ за 2-3-сут. можно вырастить 10¹⁶ – 10¹⁸ микробных клеток. В процессе жизнедеятельности клеток при их выращивании в среду поступает большое количество ценных продуктов, а сами клетки представляют собой кладовые этих продуктов.

3. Биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, антигены, антитела и др. значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез. При этом исходное сырье для биосинтеза, как правило, проще и доступнее, чем сырье для других видов синтеза. Для биосинтеза используют отходы сельскохозяйственной, рыбной,, пищевой промышленности, растительное сырье, дрожжи, древесина, меласса и др.).

4. Возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах, т.е. наличие соответствующего технологического оборудования, доступность сырья, технология переработки и т.д.

Таким образом, природа дала в руки исследователям живую систему, содержащую и синтезирующую уникальные компоненты, и, в первую очередь, нуклеиновые кислоты, с открытием которых и начала развиваться биотехнология и мировая наука в целом.

Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы, протозойные организмы, клетка (ткани) растений, животных и человека, вещества биологического происхождения (например, ферменты, простагландины, пектины, нуклеиновые кислоты,), молекулы.

В этой связи можно сказать, что объекты биотехнологии относятся либо к микроорганизмам, либо к растительным и животным клеткам. В свою очередь организм можно охарактеризовать как систему экономного, сложнейшего, компактного, целенаправленного синтеза, устойчиво и активно протекающего при оптимальном поддержании всех необходимых параметров.

Методы, применяемые в биотехнологии, определяются двумя уровнями клеточным и молекулярным. Тот и другой определяются биообъектами.

В первом случае дело имеют с бактериальными клетками (для получения вакцинных препаратов), актиномицетов (при получении антибиотиков), микромицетов (при получении лимонной кислоты), животных клеток (при изготовлении противовирусных вакцин), клеток человека (при изготовлении интерферона) и др.

Во втором случае дело имеют с молекулами, например с нуклеиновыми кислотами. Однако в конечной стадии молекулярный уровень трансформируется в клеточный.

Клетки животных и растений, микробные клетки в процессе жизнедеятельности (ассимиляция и диссимиляция) образуют новые продукты и выделяют метаболиты разнообразного физико-химического состава и биологического действия.

При росте клеток в ней осуществляется огромное число катализируемых ферментами реакций, в результате которых образуются промежуточные соединения, которые в свою очередь превращаются в структуры клеток. К промежуточным соединениям, и строительным «кирпичикам» относятся 20 аминокислот, 4 рибонуклеотида, 4 дезоксирибонуклеотида, 10 витаминов, моносахара, жирные кислоты, гексозамины. Из этих «кирпичиков» строятся «блоки»: примерно 2000 белков, ДНК, три типа РНК, полисахариды, липиды, ферменты. Образующиеся «блоки» идут на строительство клеточных структур: ядро, рибосомы, мембрана, клеточная стенка, митохондрии, жгутики и пр. из которых состоит клетка (табл. 1)

Таблица 1

Схема прохождения «биологического синтеза» клетки и продукты

синтеза, используемых в биотехнологии ( И.В. Тихонов и др. 2005)

 

Стадии биосинтеза клетки	Продукты, используемые в биотехнологии
1 .Синтез аминокислот моносахаров, жирных кислот, нуклеотидов, витаминов.   II. Синтез белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов, их комплексов   III .Образование ферментов, гормонов, антибиотиков, токсинов, антигенов, антител.   IV Образование структур клеток (ядро рибосомы, клеточная стенка, , митохондрии, жгутики и т.д.).   V. Формирование клетки	Первичные метаболиты («кирпичики»)     Макромолекулы («блоки»)     Вторичные метаболиты («блоки»)     Структура клетка («элементы»)     Клетка («цельная система»)

 

На каждой стадии «биологического синтеза» клетки можно определить те продукты, которые могут быть использованы в биотехнологии.

Обычно продукты одноклеточных делят на 4 категории:

а) сама клетка как источник целевого продукта. Например выращенные бактерии или вирусы используют для получения живой или убитой корпускулярной вакцины, дрожжи, как кормовой белок или основу для получения гидролизатов, питательных сред и т.д.

б) крупные молекулы, которые синтезируются клетками в процессе выращивания: ферменты, токсины, антигены, антитела, пептидогликаны и др.

в) первичные метаболиты – низкомолекулярные вещества (менее 1500 дальтон), необходимые для роста клеток, такие как аминокислоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты;

г) вторичные метаболиты (идиолиты) – низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста клеток: антибиотики, алкалоиды, токсины, гормоны.

Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырье, которое в результате технологической обработки превращается в конечный, пригодный для использования продукт.

Все микрообъекты, используемые в биотехнологии, относят к акариотам, про- или к эукариотам. Из группы эукариот, например, оперирует в качестве биообъектов клетками простейших, водорослей и грибов, из группы прокариот- клетками сине-зеленых водорослей и бактерий, акариот – вирусами (рис.1).

 

Рис. 1. Классификация живой природы (И.В. Тихонов и др., 2005)

 

Биообъекты из микромира варьируют в размерах от нанометров (вирусы, бактериофаги) до миллиметров и сантиметров (гигантские водоросли), и характеризуются относительно быстрым темпом размножения. В современной фарминдустрии используется гигантская гамма биообъектов, группировка которых весьма сложна и лучше всего может быть выполнена на основе принципа их соразмерности.

Градация биообъектов (И.В. Тихонов и др., 2005)

Группа	Размер
от 10 м до 1 см	от 1 см до 1 мм	от 1 мм до 1 мкм	от 1 мкм до 1 нм	от 1 нм
I   II   III     IV	Доноры (человек, лошадь, корова и др.)   Макроорганизмы- биореакторы (мышь, куриный эмбрион и др.)   Растения – био- накопители са- понинов, алка- лоидов и т.д.   Ядовитые рас-тения и животные	Гигантскиеводоросли- продуценты алгинатов     Каллусные культуры - продуценты панаксозидов, биотрансформанты   Культуры тканей (дерма)	Клетки эукариот (культуры клеток, Лейкоциты-продуценты интерферона и др.) Клетки низших эукариот (плесень, дрожжи) Клетки-химеры   Биопродуценты (клетки прокариот)   Биотрансформанты (гибридные клетки про- и эукариот)	Бакте- риофаги     Вирусы   Эпосомы	ДНК   Ферменты   Макромо- лекулы- носители

Огромная совокупность биообъектов не исчерпывает всей элементной базы, которой оперирует биотехнология. Последние успехи биологии и генной инженерии привели к появлению совершенно новых биообъектов-трансгенных (генетически-модифицированных) бактерий, вирусов, грибов, клеток растений, животных, человека и химер.

Несмотря на то, что представители всех надцарств содержат генетический материал, различные акариоты лишены какого-либо одного типа нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК). Они не способны функционировать (в том числе - реплицироваться) вне живой клетки, и, следовательно, правомочно именовать их безъядерными. Паразитизм вирусов развивается на генетическом уровне.

Бактерии имеют ленточную организацию и у них имеются нуклеиновые кислоты обоих типов - РНК и ДНК, из которых ДНК представлена в виде одиночной (кольцевидной) хромосомы. Большинство из них размножается на питательных средах (вне организма), а если среди бактерий и есть безусловные (облигатные) паразиты, приближающиеся по данному признаку к вирусам (хламидии, микоплазмы, риккетсии), то паразитизм их отличается по своему механизму - его можно назвать клеточным.

При целенаправленном обследовании различных экологических ниш выявляются все новые группы микроорганизмов-продуцентов веществ, которые могут быть использованы в биотехнологии. Количество видов микроорганизмов, используемых в биотехнологии постоянно растет.

При выборе биологического объекта во всех случаях нужно соблюдать принцип технологичности. Так, если в течение многочисленных циклов культивирования свойства биологического объекта не сохраняются или претерпевают существенные изменения, то данный биологический объект следует признать нетехнологичным, т.е. неприемлемым для следующих после стадии лабораторных исследований технологических разработок.

С развитием биотехнологии огромное значение приобретают специализированные банки биологических объектов, в частности коллекции микроорганизмов с изученными свойствами, а также криобанки клеток животных и растений, которые уже сейчас с помощью специальных методов могут быть с успехом использованы для конструирования новых, полезных для биотехнологии организмов. По сути дела, такие специализированные банки культур ответственны за сохранение чрезвычайно ценного генофонда.

Коллекции культур играют важную роль в процедуре правовой защиты новых культур и в стандартизации биотехнологических процессов. В коллекциях проводится сохранение, поддержание и обеспечение микроорганизмов штаммами, плазмидами, фагами, линиями клеток как для научных и прикладных исследований, так для и соответствующих производств. Коллекции культур кроме основной задачи - обеспечения жизнеспособности и сохранения генетических свойств штаммов - содействуют развитию научных исследований (в области таксономии, цитологии, физиологии), а также служат целям обучения. Они выполняют незаменимую функцию в качестве депозитариев патентуемых штаммов. Согласно международным правилам, патентоваться и депозитироваться могут не только эффективные продуценты, но и культуры, используемые в генетической инженерии.

Большое внимание ученые уделяют целенаправленному созданию новых, не существующих в природе биологических объектов. В первую очередь, следует отметить создание новых клеток микроорганизмов, растений, животных методами генетической инженерии. Созданию новых биологических объектов, безусловно, способствует со­вершенствование правовой охраны изобретений в области генетической инженерии и биотехнологии в целом. Сформировалось направление, занимающееся конструированием искусственных клеток. В настоящее время существуют методы, позволяющие получить искусственные клетки с использованием различных синтетических и биологических материалов, например искусственной клеточной мембраны с заданной проницаемостью и поверхностными свойствами. Некоторые материалы могут быть заключены внутри таких клеток: ферментные системы, клеточные экстракты, биологические клетки, магнитные материалы, изотопы, антитела, антигены, гормоны и др. Применение искусственных клеток дало положительные результаты в производстве интерферонов и моноклональных антител, при создании иммуносорбентов и др.

Разрабатываются подходы к созданию искусственных ферментов и аналогов ферментов, обладающих повышенной стабильностью и активностью. Например, проводится синтез полипептидов желаемой стереоконфигурации, ведутся поиски методов направленного мутагенеза с целью замены одной аминокислоты на другую в молекуле фермента. Делаются попытки построения неферментных каталитических моделей.

Как наиболее перспективные следует выделить следующие группы биологических объектов:

- рекомбинанты, т.е. организмы, полученные методами генетической инженерии;

- растительные и животные тканевые клетки;

- термофильные микроорганизмы и ферменты;

- анаэробные организмы;

- ассоциации для превращения сложных субстратов;

- иммобилизованные биологические объекты.

Процесс искусственного создания биологического объекта (микроорганизма, или тканевой клетки) состоит в изменении его генетической информации с целью исключить нежелательные и усилить нужные свойства или придать ему совершенно новые качества. Наиболее целенаправленные изменения можно выполнить путем рекомбинаций - перераспределяя гены или части генов и объединяя в одном организме генетическую информацию от двух и более организмов. Получение рекомбинантных организмов, в частности, можно осуществить методом слияния протопластов, путем переноса природных плазмид и методами генной инженерии.

К нетрадиционным биологическим агентам на данном этапе развития биотехнологии относятся растительные и животные тканевые клетки, в том числе гибридомы, трансплантаты. Культуры клеток млекопитающих уже сейчас являются продуцентами интерферона и вирусных вакцин, в недалеком будущем осуществится крупномасштабное получение моноклональных антител, поверхностных антигенов клеток человека, ангиогенных факторов.

С развитием методов биотехнологии все большее внимание будет уделяться использованию термофильных микроорганизмов и их ферментов.

Ферменты, продуцируемые термофильными микроорганизмами, характеризуются термостабильностью и более высокой устойчивостью к денатурации по сравнению с ферментами из мезофилов. Проведение биотехнологических процессов при повышенной температуре с использованием ферментов термофильных микроорганизмов обладает рядом достоинств:

1) увеличивается скорость реакции;

2) повышается растворимость реактивов и за счет этого - продуктивность процесса;

3) уменьшается возможность микробного заражения реакционной среды.

Наблюдается возрождение биотехнологических процессов с использованием анаэробных микроорганизмов, которые нередко являются также термофильными. Анаэробные процессы привлекают внимание исследователей в связи с недостатком энергии и возможностью получения биогаза. Так как при анаэробном культивировании не нужна аэрация среды и биохимические процессы менее интенсивны, упрощается система теплоотвода, анаэробные процессы можно рассматривать как энергосберегающие.

Анаэробные микроорганизмы успешно используются для переработки отходов (биомассы растений, отходов пищевой промышленности, бытовых отходов и др.) и стоков (бытовые и промышленные стоки, навоз) в биогаз.

В последние годы расширяется применение смешанных культур микроорганизмов и их природных ассоциаций. В реальной биологической ситуации в природе микроорганизмы существуют в виде сообществ различных популяций, тесно связанных между собой и осуществляющих круговорот веществ в природе.

Основные преимущества смешанных культур по сравнению с монокультурами следующие:

-способность утилизировать сложные, неоднородные по составу субстраты, зачастую непригодные для монокультур;

-способность к минерализации сложных органических соединений;

-повышенная способность к биотрансформации органических веществ;

-повышенная устойчивость к токсичным веществам, в том числе тяжелым металлам;

-повышенная устойчивость к воздействию окружающей среды;

-повышенная продуктивность;

-возможный обмен генетической информацией между отдельными видами сообщества.

Следует особо выделить такую группу биологических объектов, как ферменты-катализаторы биологического происхождения, изучением которых в прикладном аспекте занимается инженерная энзимология. Основная ее задача - разработка биотехнологических процессов, в которых используется каталитическое действие энзимов, как правило выделенных из состава биологических систем или находящихся внутри клеток, искусственно лишенных способности роста. Благодаря ферментам скорость реакций по сравнению с реакциями, протекающими в отсутствие этих катализаторов, возрастает 10⁶ – 10¹² раз.

Как отдельную отрасль создания и использования биологических объектов следует выделить иммобилизованные биологические объекты. Иммобилизованный объект представляет собой гармоничную систему, действие которой в целом определяется правильным подбором трех основных компонентов: биологического объекта, носителя и способа связывания объекта с носителем.

В основном используются следующие группы методов мобилизации биологических объектов:

- включение в гели, микрокапсулы;

- адсорбция на нерастворимых носителях;

- ковалентное связывание с носителем;

- сшивка бифункциональными реагентами без использования носителя;

- «самоагрегация» в случае интактных клеток.

Основными преимуществами использования иммобилизованных биологических объектов являются:

- высокая активность;

- возможность контроля за микроокружением агента;

- возможность полного и быстрого отделения целевых продуктов;

- возможность организации непрерывных процессов с многократным использованием объекта.

Как следует из вышеизложенного, в биотехнологических процессах возможно использование ряда биологических объектов, характеризующихся различными уровнями сложности биологической регуляции, например клеточным, субклеточным, молекулярным. Oт особенностей конкретного биологического объекта самым непосредственным образом зависит подход к созданию всей биотехнологической системы в целом.

В результате фундаментальных биологических исследований углубляются и расширяются знания о природе и, тем самым, о возможностях прикладного использования той или иной биологической системы в качестве активного начала биотехнологического процесса. Набор биологических объектов непрерывно пополняется.