Выделение, очистка, количественное определение, гидролиз нуклеиновых веществ

Лабораторная работа

Опыт 1. Выделение и качественное определение дезоксирибонуклеопротеидов

Нуклеопротеидами богаты печень, селезенка, поджелудочная железа, почки, дрожжи. Они растворяются в разбавленных растворах щелочей и выпадают в осадок при подкислении раствора. Дезоксирибонуклеопротеиды хорошо растворяются также в солевых растворах.

Выполнение опыта

2-2,5 г печени или селезенки разрезают на маленькие кусочки и затем растирают в ступке с добавлением небольшого количества стеклянного порошка. Затем, продолжая измельчение, в ступку вносят небольшими порциями (по 10-15 мл) 5%-ный раствор хлорида натрия до общего объема 80 мл. Растирание проводят в течение 15-20 минут до получения гомогенной массы. Содержимое ступки разливают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 15 минут (при 2500 об/мин), после чего измеряют объем центрифугата.

В стакан наливают дистиллированную воду (объем которой должен быть в три раза больше объема центрифугата) и, медленно помешивая в стакане деревянной палочкой с насечками, вливают в воду центрифугат. Дезоксирибонуклеопротеиды выпадают в виде нитей, которые наматываются на палочку.

Если нити дезоксирибонуклеопротеидов не образовались, а выделился хлопьевидный осадок, то ему дают отстояться, после чего осветлившуюся часть жидкости осторожно декантируют, а оставшуюся часть центрифугируют.

Полученный осадок растворяют при постепенном добавлении 0,4%-ного раствора гидроксида натрия.

Химический состав выделенных соединений устанавливают при помощи цветных реакций.

Наличие ДНК определяют по реакции с дефиниламином, который образует с дезоксирибозой или ДНК соединения синего цвета. Рибоза и РНК дают с дифениламином зеленое окрашивание.

В пробирку наливают 1-2 мл полученного раствора дезоксирибонуклеопротеида, добавляют равный объем дифениламинового реактива (получают растворением 1 г дифениламина в 100 мл ледяной уксусной кислоты с последующим добавлением 2,75 г концентрированной серной кислоты). Осадок, выпадающий вначале, растворяется в последующих порциях реактива. Полученный раствор нагревают в течение 15-20 минут в кипящей водяной бане.

Биуретовая реакция на белок

К 1-2 мл раствора дезоксирибонуклеопротеида приливают несколько капель 1%-го раствора сульфата меди. Наличие белка устанавливают по характерному сине-фиолетовому окрашиванию.

Опыт 2. Выделение, очистка и разделение нуклеиновых кислот (по Шмидту и Таннгаузеру, в прописи Г.П. Георгиева)

Выполнение опыта

(Для последующего проведения опытов 3 и 4 все описанные ниже процедуры проводят в двух параллелях).

Процесс выделения, очистки и разделения нуклеиновых кислот проводят следующим образом:

1) 1 г исследуемой охлажденной ткани (печень, почки) измельчают в фарфоровой ступке с небольшим количеством 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты до получения однородной тонкой кашицы (ступку охлаждают льдом), которую, количественно смывая со стенок ступки 5 мл 10%-ного холодного раствора трихлоруксусной кислоты, переносят в центрифужную пробирку. Центрифугируют 7 минут (3000 – 4000 об/мин) в центрифуге с охлаждением или низкотемпературной комнате. Жидкость над осадком сливают, к осадку вновь приливают 5-10 мл 10%-ного холодного раствора трихлоруксусной кислоты и снова центрифугируют. Операцию повторяют в третий раз.

В осадке остаются нуклеиновые кислоты, белки и липиды, в промывные воды переходят низкомолекулярные производные азотистых оснований (в том числе нуклеотиды) и неорганические фосфорные соединения.

Внимание! Все операции необходимо проводить при низкой температуре во избежание отщепления пуринов (апуринизации) и последующего разрыва цепей ДНК при щелочном гидролизе.

2) Осадок освобождают от липидов путем экстракции органическими растворителями, для чего его растирают стеклянной палочкой и последовательно центрифугируют с этиловым спиртом, два раза со смесью спирта с хлороформом (3:1), затем со смесью спирта с эфиром (3:1) и, наконец, с эфиром. Каждый раз берут по 10 мл растворителя. Промытый осадок высушивают в вытяжном шкафу (для ускорения высушивания осадок растирают стеклянной палочкой). В осадке остаются нуклеиновые кислоты и белки.

3) Разделение ДНК и РНК.

При мягком щелочном гидролизе РНК расщепляется до нуклеотидов, тогда как ДНК остается полимерной и выпадает в осадок при добавлении кислоты (хлорной или трихлоруксусной).

К высушенному на воздухе и растертому в порошок осадку добавляют 5-10 мл 0,5 н KOH и ставят на 15-18 часов в термостат при 37^оС, после чего охлаждают до 0-2^оС и добавляют холодный 50%-ный раствор трихлоруксусной кислоты с таким расчетом, чтобы довести концентрацию кислоты в нем (после нейтрализации щелочи) до 5%.

После добавлении кислоты гидролизат в течение 5 минут выдерживают в холодильнике при 0^оС и затем центрифугируют.

В надосадочной жидкости содержатся нуклеотиды, которые высвободились при гидролитическом расщеплении РНК. Надосадочную жидкость сливают. В осадке остаются ДНК и белки.

4) Осадок растворяют в 1-2 мл 0,5 н KOH при 37^оС, затем охлаждают до 0^оС. Нерастворимый остаток отбрасывают.

В результате параллельных опытов получают два раствора, содержащих ДНК. Один из растворов используют для количественного определения ДНК по фосфору, а другой – для получения и разделения свободных пуриновых и пиримидиновых оснований.

Опыт 3. Количественное определение нуклеиновых кислот (ДНК) по фосфору

Определение по фосфору считается наиболее надежным методом количественной оценки нуклеиновых кислот, так как его процентное содержание в наименьшей степени зависит от нуклеотидного состава: для ДНК оно составляет 9,8-10,1%, для РНК – 9,1-9,6 %. При определении фосфора нуклеиновых кислот в тканях необходимо предварительно удалить свободные нуклеотиды, неорганический фосфат, а также все фосфорсодержащие соединения ненуклеотидной природы, в частности липиды.

Выполнение опыта

Первым этапом определения является минерализация ДНК-содержащей пробы. Для этого один из растворов, полученных после выделения, очистки и разделения нуклеиновых кислот, помещают в колбу Кьельдаля или жаростойкую пробирку, при необходимости упаривают на водяной бане до объема 1-2 мл, а затем добавляют около 1 мл концентрированной серной кислоты. Укрепив колбу (пробирку) слегка наклонно, осторожно нагревают раствор на плитке до тех пор, пока полностью не выпарится вода и раствор в колбе приобретет бурую окраску (при малом содержании органического вещества в пробе бурую окраску можно не заметить). После этого колбу (пробирку) охлаждают, осторожно добавляют 2-3 капли 30%-ной перекиси водорода и раствор снова нагревают. (При появлении бурой окраски добавление перекиси водорода повторяют несколько раз). Нагрев при минерализации не должен быть слишком интенсивным: нельзя допускать, чтобы тяжелые пары серной кислоты и диоксид серы выходили из колбы, так как вместе с ними частично увлекается фосфат.

По окончании минерализации содержимое колбы (пробирки) количественно переносят в мерную колбу на 25 мл. В наполненную разбавленным минерализатом примерно наполовину колбу добавляют 1-2 капли фенолфталеина и нейтрализуют кислоту 5 н раствором щелочи до слабо-розовой окраски. Затем уровень раствора в колбе доводят дистиллированной водой до метки.

Определение содержания фосфата в пробе проводят методом Самнера. К разбавленному минерализату, содержащему 0,05-0,5 мкмоль фосфата, приливают дистиллированную воду до 3,6 мл, добавляют 0,5 мл 6,6%-ного раствора молибдата аммония, 0,5 мл 7,5 н раствора серной кислоты и 0,4 мл свежеприготовленного раствора сульфата железа (II). Пробы перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 40 минут, после чего фотометрируют при 625 нм. Калибровочный график строят с использованием стандартного раствора фосфата (KH₂PO₄), содержащего 0,5 мкмоль/мл фосфора.

Концентрацию фосфора в гидролизате находят по калибровочному графику и затем проводят пересчет на содержание ДНК в исследуемом образце животной ткани.

Опыт 4. Получение и разделение свободных пуриновых и пиримидиновых оснований

Свободные пуриновые и пиримидиновые основания являются компонентами ДНК и РНК и освобождаются при их гидролитическом расщеплении. Подвергая гидролизу ДНК действием концентрированных растворов минеральных кислот (например, 6 н соляной кислоты или 12 н хлорной) при 100^оС можно добиться почти количественного освобождения пуриновых и пиримидиновых оснований. Для высвобождения нуклеозидов и нуклеотидов следует применять более мягкий метод – ферментативный.

Значительно легче гидролизуются РНК. Уже 1 н раствор серной или соляной кислот расщепляют РНК до пуриновых оснований и пиримидиновых нуклеотидов. Этот способ гидролиза позволяет установить неодинаковую прочность гликозидных связей в пуриновых и пиримидиновых нуклеотидах, так как последние в данных условиях почти не подвергаются дальнейшему расщеплению. Пиримидиновые основания освобождаются лишь при гидролизе РНК 12 н раствором хлорной кислоты (1 ч при 100^оС). Для выделения свободных мононуклеотидов проводят расщепление РНК 0,3 н раствором гидроксида натрия в течение 18 часов при температуре 37^оС.

Разделение полученной при гидролизе смеси оснований проводят методом тонкослойной хроматографии с использованием пластинок Силуфол UV-254.

В методе тонкослойной хроматографии разделение обеспечивается движением подвижной фазы через нанесённый на подложку тонкий слой сорбента. В качестве сорбентов чаще всего применяют диоксид кремния, силикагель и оксид алюминия, а также другие материалы (активированный уголь, сахарозу, карбонат кальция, тальк и др.). Выбор растворителя (подвижной фазы) определяется природой сорбента и свойствами разделяемых веществ. Продвижение органического растворителя по пластине так же, как и в бумажной хроматографии, обеспечивается капиллярными силами.

Хроматографическое разделение методом тонкослойной хроматографии проводят в разделительной камере с притёртой крышкой. Положение зоны хроматографируемого компонента устанавливают по величине коэффициента R_f, равной отношению скорости движения его зоны к скорости движения фронта растворителя.

Выполнение опыта

К одному из растворов, полученных при выделении, очистке и разделении нуклеиновых кислот, приливают 3 мл концентрированной соляной кислоты и выдерживают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 3 часов. По окончании гидролиза полученный раствор нейтрализуют 20%-ным раствором NaOH (постепенно добавляя раствор щелочи и периодически отбирая несколько капель раствора для определения характера рН среды с помощью фенолфталеина).

На хроматографических пластинках простым карандашом проводят стартовую линию на расстоянии 2,5 см от нижнего края. На стартовую линию в 2-3 подхода наносят несколько капель охлажденного гидролизата (пятно после каждого нанесения подсушивают на воздухе или высоко над нагретой плиткой). Пластинки помещают в хроматографические камеры (стеклянные цилиндры), в которые предварительно вносят 10-15 мл щелочного растворителя (н-пропано:25% аммиак:вода в соотношении 60:30:10. Когда растворитель поднимется на 4/5 высоты пластинки, ее вынимают, высушивают под тягой и просматривают при УФ-облучении. Пятна оснований четко локализованы благодаря флуоресцирующему носителю.