Гель-хроматография

Разделение белков по молекулярной массе

Метод мембранных сит (диализ)

Отделение белков от низкомолекулярных примесей

МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ

ЭТАПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

 

1. Выделение белка из смеси в чистом виде (по одному из признаков: размер молекулы, заряд, специфическое сродство связывания). Определение молекулярной массы белка.

2. Определение N-концевой АК.

3. Определение С-концевой АК.

4. Определение АК-последовательности белковой цепи.

 

Выделение белка из биологического материала основано на его физико-химических свойствах. Чаще всего для этих целей используют кислотно-основные свойства белков (амфотерность, заряд молекулы, изоэлектрическое состояние).

От заряда белковых молекул зависит их:

- растворимость (минимальна в ИЭТ);

- электрофоретическая подвижность;

- структура и биологическая активность.

При растворении в водной среде на поверхности белковой молекулы формируется гидратная оболочка.

Устойчивость белка в растворе зависит:

1) от заряда белковой молекулы;

2) наличия гидратной оболочки;

3) от молекулярной массы белка.

Для выделения нативных белков (без изменения пространственной структуры) используют метод высаливания:

- осаждение солями щелочноземельных металлов: хлорид натрия, сульфат аммония;

- осаждение другими водоотнимающими веществами: спиртом или ацетоном при низких температурах (около –20 °С).

При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок.

Денатурация — нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов).

 

Используют диализную мембрану, которая является полимером и имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом, белки отмывают от примесей.

Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки (рис. 2.1). Размер белка зависит от его молекулярной массы.

Рис. 2.1. Разделение белков методом гель-фильтрации