Характеристика компонентов, используемых в ИФА

Классификация ИФА

Практическое применение ИФА

Иммуноферментный анализ

Алгоритм лабораторной диагностики. Биохимический анализ крови.

1. Определение уровня ТГсыворотки крови. При атеросклерозе уровень ТГ повышен. В норме концентрация ТГ в сыворотке крови составляет 0,50-2,10 ммоль/л.

2. Определение уровня общего ХС сыворотки крови. При атеросклерозе уровень общего ХС сыворотки крови повышен. В норме концентрация общего ХС в сыворотке крови составляет 3,3-5,2 ммоль/л. Незначительная гиперхолестеринемия: 5,2—6,5 ммоль/л. Умеренная гиперхолестеринемия: 6,7—7,8 ммоль/л. Тяжелая гиперхолестеринемия: >7,8 ммоль/л.

3. Определение уровня холестерина ЛПВП сыворотки крови. При атеросклерозе уровень холестерина ЛПВП понижен. В норме концентрация холестерина ЛПВП составляет 0,9-1,9 ммоль/л.

4. Определение уровня холестерина ЛПНП сыворотки крови. При атеросклерозе уровень холестерина ЛПНП повышен. В норме концентрация холестерина ЛПНП составляет < 2,2 ммоль/л.

5. Определение уровня холестерина ЛПОНПсыворотки крови. При атеросклерозе уровень холестерина ЛПОНП повышен. Холестерин ЛПОНП рассчитывается по формуле:

ХС ЛПОНП = Общий ХС — ХС ЛПВП — ХС ЛПНП

6. Определение коэффициента атерогенности: КХС = ХСобщ - ХСЛПВП / ХСЛПВП

В норме в возрасте 40–60 лет без клинических проявлений атеросклероза КХС не превышает 3,0–3,5. Вероятность развития атеросклероза относительно невелика при КХС менее 3,0. КХС в пределах 3,0–4,0 ассоциируется с умеренным, больше 4,0 — с высоким риском атеросклероза.

7. Определение ano-B-протеина в сыворотке крови. При атеросклерозе уровень ano-B-протеина в сыворотке крови повышен. В норме содержание апо-В-протеина в крови составляет у мужчин — 0.60—1.38 г/л, у женщин — 0.52—1.29 г/л. Повышение содержания апо-В-протеина ассоциируется с высоким уровнем ЛПНП и является важным маркером риска атеросклероза.

 

ИФА нашел широкое применение в различных областях медицины и биологии благодаря относительной простоте и высокой чувствительности метода. ИФА успешно применяется для:

• массовой диагностики инфекционных заболеваний;

• выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов;

• определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена;

• выявления иммунных комплексов;

• выявления онкомаркеров;

• определения общего IgE и специфических IgE антител;

• скрининга моноклональных антител.

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делятся на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения метод относится к группе гомогенных.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

Ферменты. Ферментные метки обладают чрезвычайно мощным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. В ИФА наибольшее применение нашли пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза и β-D-галактозидаза.

Субстраты. Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична. Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество.

Антигены и антитела. АГ и AT должны быть высокоочишенными и высокоактивными. Используемые антитела могут быть поли- или моноклональными, различного класса (IgG или IgM).

Образование конъюгата. Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно.

Твердая фаза. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.