Динамический анализ функции тромбоцитов

Таблица 11

 

 

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

рекомендует для коагулологических исследовании буферный раствор 3,2% цитрата. Забуферивание ан­тикоагулянта способствует большей стабилизации лабильных факторов свертывания. Хранение ра­створа цитрата допускается в течение 1 недели при +2...+8 °С. Более длительное хранение приводит к бактериальному загрязнению и снижению концен­трации цитрата натрия.

Вторая ошибка связана с тем, что нарушает­ся принятое соотношение крови и раствора цит­рата (9:1), поскольку раствор цитрата остается в плазме и не проникает в клетки крови. Считает-

ся, что в пределах разведения крови цитратом 9:1 и 12:1 практически нет различий в результатах коагулологических тестов. Большее количество антикоагулянта по отношению к плазме может вызвать удлинение ПВ и АЧТВ (рис. 70).

Такая ситуация может возникнуть, когда в приготовленную заранее пробирку с цитратом набрано слишком мало крови (рис. 71).

Аналогичная ситуация возникает при раз­ном гематокрите (рис. 72): гематокрит в преде­лах между 0,25-0,55 (25-55%) несущественно вли­яет на результаты, при гематокрите свыше 60%

Рис. 70. Влияние разведе­ния крови антикоагулян­томна протромбиновый тест (ПТ) и активированное частичное тромбопластино-вое время (АЧТВ), Разведе­ние крови антикоагулянтом сопровождается удлинени­ем ПВ (снижение ПТ) и АЧТВ, при разведении меньшем, чем 8:1, это приводит к ре­гистрации ложноположи-тельного результата

 

 

Рис. 71. Взято недостаточное количество крови в ан­тикоагулянт- типичная преаналитическая ошибка. Боль­шее количество антикоагулянта по отношению к плазме может вызвать значительное изменение показателей ко-агулограммы

Рис.72. Соотношение объема плазмы и раствора цитра­та при разном гематокрите. При высоком гематокрите со­здаются условия избыточного количества антикоагулянта и слишком сильного разведения плазмы с получением ре­зультатов, соответствующих состоянию гипокоагуляции. Наоборот, при низком гематокрите есть высокая вероят­ность регистрации «ложной» гиперкоагуляции

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

создается избыточная концентрация цитрата в плазме, приводящая к «ложной» гипокоагуля-ции. Напротив, при снижении гематокрита (ниже 25%) обнаруживается «ложная» гиперко­агуляция, кровь при смешивании с цитратом в отношении 9:1 может свернуться в пробирке еще до исследования. Высокий гематокрит - физио­логическая характеристика крови новорожден­ных, у взрослых высокий гематокрит возникает при полицитемиях (эритремиях), сердечной не­достаточности.

Перерасчет объема стабилизатора в соответ­ствии с гематокритным показателем позволяет избежать этой ошибки (табл. 12). Если же у боль­ного нет значительного сгущения крови или, на­оборот, анемизации, приемлемо стандартное со­отношение крови и цитрата (9:1).

Таблица 12

Соотношение объема антикоагулянта и венозной крови для постановки коагулограммы

Третья ошибка. Наиболее частой погрешно­стью при взятии крови является плохое или недо­статочное перемешивание ее со стабилизатором. Для предотвращения этого требуется немедлен­но после заполнения пробирки кровью до требу­емого объема закрыть ее крышкой (не резиновой) или чистой полиэтиленовой пленкой и 2-3 раза медленно перевернуть (не встряхивая).

Для рекальцификации к цитратной плазме добавляют определенное количество хлорида кальция. Причиной изменения времени сверты­вания может стать несоответствие добавляемо­го кальция содержанию цитрата: коагулологи-ческие исследования являются более чувстви­тельными к избытку кальция в плазме (высокий

гематокрит, слишком мало крови), чем к его не­достатку (низкий гематокрит, слишком много крови).

Для некоторых тестов рекомендуются специ­альные антикоагулянты. При исследовании фун­кции тромбоцитов практически любой антикоа­гулянт может быть источником ошибок. ЭДТА, флуорид и гепарин не используются при прове­дении традиционных тестов коагулограммы.

Сыворотка

Сыворотка, естественно, не может быть ис­пользована в тестах, основанных на определении выпадения фибрина. Кроме того, сыворотка практически не содержит факторов II, V, VIII и XIII, которые удаляются со сгустком, в сыворот­ке частично сохраняются ф.VII, -IX, -X и -XII. Сы­воротку можно использовать для исследования некоторых компонентов, на определение которых оказывают интерферирующий эффект компонен­ты плазмы, в частности, в сыворотке можно оп­ределять содержание продуктов деградации фиб­рина/фибриногена (ПДФ).

Хранение и центрифугирование

Кровь в пробирке необходимо тщательно перемешать, перевертывая пробирку, при этом не допускается образования пены. Нельзя трясти пробу, так как это может вызвать денатурацию белков и активацию тромбоцитов.

Сразу же после взятия крови происходит из­менение активности компонентов системы свер­тывания и фибринолиза. В пробе, не закрытой пробкой, возрастает рН из-за потери СО₂. След­ствием этого является увеличение времени свер­тывания. На стабильность рН пробы влияет бу­ферная система эритроцитов, а также использо­вание буферных растворов цитрата. В пробе кро­ви, хранящейся при комнатной температуре и зак­рытой пробкой, не происходит заметных измене­ний в результатах ПВ и АЧТВ. Эффект физиоло­гического забуферивания за счет эритроцитов исчезает в открытой пробирке при попадании в нее атмосферного воздуха.

Согласно международным рекомендациям срок доставки проб в лабораторию (ARUP Laboratories, 2002) для исследования показате-

 

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

лей гемостаза не должен превышать 45 минут

после взятия крови у пациента. Стабилизиро­ванную кровь до центрифугирования (в том числе и в процессе транспортировки) хранят при комнатной температуре (+18... +25 °С). Транспортировка крови на большие расстоя­ния и ее частое встряхивание искажают резуль­таты исследования. Кровь нельзя хранить во льду (что делается в некоторых клиниках), так как это может привести к холодовой актива­ции фактора XII (процесс запускается через контактную фазу и развивается достаточно ча­сто) и вызвать значительные изменения функ­ции тромбоцитов.

Центрифугирование для получения плазмы должно проводиться при ускорении 1500-2000 g в течение 10 минут, при этом получается плазма, «бедная» тромбоцитами. Если пробы необходи­мо заморозить перед проведением теста, то пос­ле размораживания рекомендуется повторно от-центрифугировать пробу и работать с суперна-тантом. Это делается для удаления остатков раз­рушенных тромбоцитов, фосфолипидов и белков их мембран, которые могут влиять на некоторые коагуляционные тесты.

Проверка исследуемых образцов перед выполнением тестов

Проверка образцов крови или плазмы перед проведением коагуляционных тестов позволяет избежать многих ошибок, связанных с преанали-тическими погрешностями.

Неправильное соотношение кровь/цитрат можно определить, если объем крови в пробирке меньше или больше, чем требуемый. При малом объеме крови будет зарегистрировано ложное удлинение коагуляционных тестов.

Пробы с видимыми сгустками фибрина. В за­висимости от степени свертывания коагуляцион­ные тесты могут быть укорочены, нормальны или удлинены.

Гемолиз может произойти при хранении не-отцентрифугированной крови или после центри­фугирования. В таких тестах результаты варьи­руют в зависимости от степени гемолиза. Если гемолиз присущ in vivo, что подтверждается взя­тием нового образца, то тесты могут выполнять­ся для оценки гемостатической ситуации. Если гемолиз произошел после взятия крови, то такие образцы следует отбросить, чтобы не получить ложных результатов.

Тесты для оценки сосудистого и тромбоцитарного компонентов гемостаза

 

Традиционные тесты на исследование сосу­дистого и тромбоцитарного компонентов гемо­стаза, в том числе пробы на резистентность (ломкость) капилляров, пробы на длительность и величину капиллярного кровотечения, под­счет тромбоцитов в камере, изучение размеров тромбоцитов в мазке, визуальные методы на

.

спонтанную и индуцированную агриегацю, хо­рошо известны и представлены во многих по­собиях. В настоящем изложении остановимся только на относительно новых методах, отра­ботанных на новой лабораторной технике, по­ступающей в клинико-диагностические лабора­тории.

Время кровотечения

Время кровотечения - это время от момента нанесения стандартной раны кожи до момента прекращения вытекания крови. Оно характери­зует функциональную активность тромбоцитов и взаимодействие тромбоцитов с сосудистой стен­кой. Время кровотечения не выявляет всех тром-боцитарных нарушений (такого метода вообще не существует), этот скрининговый тест позволя­ет заподозрить тромбоцитопатии различного ге-

неза, болезнь Виллебранда и нарушения проаг-регантных свойств сосудистой стенки. После вы­явления патологии нет необходимости повторять это исследование, нужно использовать более чув­ствительные и специфичные методы. У этого ме­тода есть серьезные недостатки: Метод плохо стандартизуется. Результаты

теста позволяют лишь предположить наличие

тех или иных нарушений.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Низкая чувствительность. Отсутствие удли­нения времени кровотечения не всегда позво­ляет исключить нарушения тромбоцитарно-го или сосудистого звеньев гемостаза. Низкая специфичность не позволяет одно­значно интерпретировать результаты метода.

Однако это наиболее доступный метод для вы­явления нарушений взаимодействия тромбоцитов с сосудистой стенкой. Кроме того, это дешевый ме­тод, позволяющий заподозрить нарушения соответ­ствующего звена гемостаза и решить вопрос о необ­ходимости дальнейших углубленных исследований.

Новым подходом в лабораторной диагности­ке является имитирование тромбоцитарного гемо­стаза на приборе PFA-100® (фирма «Dade Behring», Германия). В PFA-100 в измерительном картрид­же цитратная кровь пропускается через капилляр диаметром 150 мкм, моделирующий микрососуд, покрытый пленкой из коллагена/адреналина или коллагена/АДФ (рис. 73-74). Это сопровождается образованием тромбоцитарной пробки, что оце­нивается по перфузионному давлению. Останов­ка перфузии фиксируется как «время окклюзии сосуда». Метод позволяет эффективно с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять дефицит фактора Виллебранда, функциональные нарушения тромбоцитов, вызванные аспирином, наследственные и приобретенные нарушения ад­гезии и агрегации тромбоцитов. С применением

2 агонистов (индукторов агрегации) возможно се­лективное выделение аспириновых тромбоцитопа-тий. По типу измерения PFA-100 является дина­мическим агрегометром.

На практике трудно наработать материал с первичным нарушением гемостаза, чтобы уста­новить референтные значения теста, так как боль­ных с однородными нарушениями достаточно мало. При тромбоцитопатиях, вызванных дли­тельным приемом антитромбоцитарных препара­тов, очень много различных вариантов измене­ний первичного гемостаза. Тем не менее метод по­зволяет выявлять ранние признаки нарушений первичного гемостаза и, по-видимому, имеет большие перспективы для внедрения в коагуло-логические лаборатории и лаборатории экспресс-диагностики.

 

Рис. 73. Динамический агрегометр PFA-1OO.Он позво­ляет наблюдать in vitro за процессом закупорки сосуда при моделировании этого процесса в специально созданном картридже. Образование тромбоцитарной пробки оцени­вается по перфузионному давлению

Рис. 74. Датчик динамического агрегометра PFA-1OOсо­держит капилляр, моделирующий микрососуд. В цельной кро­ви, проходящей по капилляру, активируется образование сгу­стка, На стенках нанесен коллаген и адреналин или АДФ, которые являются первичной причиной запуска гемостаза

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Тромбоцитарные показатели

Число тромбоцитов (Platelets, PL, PLT)

При подсчете на автоматических анализато­рах тромбоциты распознаются по размерам в ди­апазоне 2-20 фл (рис. 75). Автоматические счет­чики позволяют получать достаточно надежные результаты по количеству тромбоцитов. При под­счете тромбоцитов в камере Горяева коэффици­ент вариации составляет 7-15%, тогда как авто­матический подсчет воспроизводится с точностью до 2-4%. Современные анализаторы сигнализи­руют (флагирование на бланке) о выходе количе­ства тромбоцитов за референтные пределы, на­личии агрегатов тромбоцитов, макротромбоци­тов или других элементов, сравнимых по объему с тромбоцитами (микроэритроциты).

Ложное занижение числа тромбоцитов может быть при их агрегации, агглютинации под дей­ствием тромбоцитарных агглютининов и при прилипании тромбоцитов к лейкоцитам (тромбо-цитарный «сателлитизм»). При подсчете на гема­тологических анализаторах в качестве антикоа­гулянта используется ЭДТА. При наличии ауто-антител к тромбоцитам калиевая соль ЭДТА ини­циирует агрегацию тромбоцитов, что проявляет­ся псевдотромбоцитопенией.

Средний объем тромбоцита (MPV)

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и нахо­дится в обратной зависимости от числа тромбо­цитов. Такое соотношение определяет постоянство тромбоцитарной массы в циркулирующей крови. MPV увеличивается с возрастом; отмечено, что у мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагу­лянта вызывает изменение формы тромбоцитов от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличивать­ся, а при высокой концентрации (1:4) - не изменя­ется со временем. Кроме типа применяемого ан­тикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние тем­пература окружающей среды. Преходящее увели­чение MPV отмечается у рабочих, контактирую­щих с асфальтовыми испарениями, органически­ми растворителями. MPV - важный диагностичес­кий показатель функции тромбоцитов. Причины изменения MPV представлены в табл. 13.

Таблица 13

Причины изменения MPV

 

 

Рис. 75. Гистограмма тромбоцитов,которая изобража­ется при представлении результатов счета клеток крови на гематологических анализаторах, Помимо гистограммы, ге­матологические анализаторы представляют результаты подсчета количества тромбоцитов (PLT), среднего объема тромбоцитов (MPV), дисперсии распределения тромбоци­тов по объему (PDW), тромбоцитокрита (РСТ)

Дисперсия распределения тромбоцитов по объему (PDW)

PDW - показатель, являющийся мерой ге­терогенности размеров (анизоцитоза) тромбо-

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

 

мов тромбоцитов или произведением среднего объема тромбоцитов на их число:

цитов. Величина PDW в среднем составляет 10-15%.

Как артефакт, ложнозавышенное увеличение PDW может быть связано с присутствием микро-цитов, шизоцитов, микроагрегатов тромбоцитов, фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

Этот показатель находится в обратной зави­симости от числа тромбоцитов и их периода жиз­ни. В каждом конкретном случае важна не толь­ко величина PDW, но и ее динамика во времени, а также связь с другими тромбоцитарными по­казателями. Так, увеличение PDW с одновремен­ным снижением MPV свидетельствует о преоб­ладании микротромбоцитов среди общей попу­ляции тромбоцитов (указывает на угнетение тромбоцитопоэза), а сочетание повышенного PDW с увеличением MPV отражает нарастание числа макротромбоцитов (усиление продукции тромбоцитов). Одновременное присутствие фракций макротромбоцитов и микротромбоци­тов ведет к увеличению PDW, но MPV может ос­таваться в пределах нормы. В современных ге­матологических анализаторах отдельными пока­зателями указывается процентное содержание микротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбо­цитов (MacroPLT).

PDW может применяться для дифференци­альной диагностики. Так, увеличение PDW свы­ше 10,5% было обнаружено у 50% больных эссен-циальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с ре­активным тромбоцитозом и лишь у 14% здоро­вых людей.

Тромбоцитокрит (РСТ)

РСТ - показатель, характеризующий процент тромбоцитарной массы в объеме крови: вычис­ляется суммированием прямо измеренных объе-

У здорового человека показатель стремится остаться стабильным: при уменьшении числа тром­боцитов усиливается тромбопоэз, в циркулирую­щую кровь выбрасывается большее число моло­дых макротромбоцитов, что ведет к увеличению MPV. При увеличении количества циркулирую­щих тромбоцитов снижается продукция их в кост­ном мозге, тем самым уменьшается процент мак­ротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако при нарушении этого равновесия происходит или уменьшение РСТ, что в конечном счете приводит к патологии первичного гемостаза и риску возник­новения кровотечений, или повышение РСТ, уве­личивающее активность тромбоцитов и их способ­ность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

Нормальные значения РСТ варьируют в пре­делах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что сниже­ние РСТ менее 0,1% обусловило возникновение послеоперационных кровотечений у пациентов с развившейся тромбоцитопенией. Также было от­мечено, что этот показатель оказался более чув­ствительным для оценки риска возникновения кровотечения, чем число тромбоцитов.

Если скрининговые методы указывают на нарушение функции тромбоцитов, необходимо выполнить специальные тесты с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых паци­ентом (отмена за 7-10 суток перед исследовани­ем глюкокортикостероидов, аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств, адреноблокаторов, блокаторов кальциевых кана­лов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаве­рина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина, антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).