Лабораторная диагностика ньюкаслской болезни

 

Ньюкаслская болезнь (НБ), псевдочума птиц - высоко контагиозная вирусная инфекция, главным образом куриных, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом, множественны­ми точечными кровоизлияниями и поражением внутренних органов. Зарегистрирована на всех континентах. Наносит громадный экономический ущерб и относится к особо опасным инфекциям. Её впервые диагностировал и описал Краневельд в 1927 г. на острове Ява.

При характерном течении болезни постановка диагноза не представляет сложности. При вспышке болезни на фоне пассивного или поствакцинального иммунитета, а тем более в стационарно неблагополучном хозяйстве поставить диагноз бывает чрезвычайно трудно. В этих случаях тщательно изучают эпизоотическую ситуацию, клиническую и патологоанатомическую картину. Решающее значение имеют лабораторные исследования - выделение ви­руса на КЭ, его индикация и идентификация в РГА - РТГА, определение вирулентности ви­руса на КЭ и цыплятах, а также выявление АТ в сыворотке переболевших или вакциниро­ванных птиц в РТГА.

Выделение вируса. Вирус, в зависимости от его тропизма можно выделить из головного и костного мозга, трахеи, кишечника, селезенки, легких, печени. Для исследования рекомендуется брать голо­ву, легкие, трахею и селезенку от только что павших или вынужденно убитых птиц. Вирус удается выделить только в период вспышки болезни. Через 15 дн выделить его обычными методами, как правило, не удается. Поэтому патологический материал необходимо брать в начале вспышки (в первые 3-5 дн) и направлять в лабораторию в термосе со льдом. Внут­ренние органы можно помещать в стерильный 50%-ный р-р глицерина на дистиллирован­ной воде. Смывы из трахеи и клоаки лучше консервировать на холоде или при температуре не выше 4°С. Мазки-отпечатки исследуют методом ФА, срезы - с помощью ЭМ или ИЭМ, а суспензию -вРГА. Это позволит выявить специфический АГ (вирус) и ГА-агент в течение 3-5 ч, определить направленность дальнейших исследований.

Заражение КЭ.Эмбрионы 9-11-дн возраста заражают по 0,2 мл, не менее 10 КЭ на ка­ждый материал, в аллантоисную полость общепринятым методом и инкубируют 72 ч при 37,5°С (погибших в первые 24 ч эмбрионов не учитывают). Если через 72 ч нет погибших КЭ, то 5 из партии зараженных убивают, оставляя их при 4°С на ночь. Остальные 5 КЭ ин­кубируют до 120 ч и затем убивают. Аллантоисную жидкость от погибших и живых КЭ проверяют на ГА в РГА с куриными эритроцитами (1-5%-ная взвесь). Обычно велогенные штаммы вируса вызывают гибель КЭ уже через 32-60 ч после заражения, мезогенные - че­рез 60-90, а лентогенные - через 100 ч и более. Иногда при первом пассаже не удается выде­лить вирус, поэтому необходимо провести не менее
3-х "слепых" пассажей. Учитывая, что в вакцинируемых стадах можно выделить и вакцинный вирус (шт. Н, Lа Sоtа,
Бор 74/ВГНКИ и др.), вторым этапом исследования должно быть определение патогенности выделенного изолята. Первым ориентиром могут служить данные РГА. Обычно полевые изоляты обла­дают низкой ГА-активностью, проявляя ее в разведениях 1:16 -1:128, тогда как вакцинные штаммы, наоборот, проявляют высокий ГА-титр - 1:256 - 1:2048.

Ненадежным оказался метод выделения вируса от зараженных иммунных кур: чем вы­ше иммунитет у несушек, тем меньше вероятности выделения вируса из их эмбрионов. При исследовании большого количества полевых образцов на выделение вируса НБ можно ис­пользовать фрагменты ХАО, связанные с яичной скорлупой. Для этого фрагменты ХАО размером 0,6-1,0 см² культивируют в среде Игла. Эффективность выделения вируса 97%. При внесении вируса в среду культивирования или непосредственно на ХАО КЭ получены совпадающие результаты.

Заражение культуры клеток.Выделение вируса в культуре клеток осуществляется редко, так как культуральный вирус по ГА-активности значительно уступает эмбрионально­му. Однако в тех случаях, когда в лаборатории можно получить культуру фибробластов КЭ и специалисты владеют этим методом, его можно применять для выделения и идентифика­ции вируса. Приготовление вирусной суспензии, выращивание и заражение культуры клеток куриных фибробластов производят общепринятым методом. Можно использовать переви­ваемые линии ВНК-21 и Нер-2.

В зараженной культуре фибробластов КЭ вирус НБ через 48-60 ч вызывает ЦПИ, спе­цифичность которых подтверждается реакцией гемадсорбции с эритроцитами кур. С вируссодержащей культуральной жидкостью может быть поставлена РГА в отношении эритроци­тов крови кур. Обычно при первичном выделении ГА-титр культурального вируса не пре­вышает 1:32 - 1:128. Отсутствие или низкие титры ГА вируса в первом пассаже на культуре ткани не дают основания исключить НБ.

Заражение птиц.Если КЭ под руками нет, вирус можно выделить на неиммунной к НБ птице. Для этого испытуемый материал 1:10 (0,5 мл) внутримышечно инокулируют цыпля­там в возрасте 2-4 мес. За инфицированной птицей наблюдают 10-12 дн. При появлении ха­рактерных для болезни симптомов птиц в атональном состоянии убивают и берут пробы го­ловного мозга и селезенки, которые можно использовать для заражения КЭ и иммунологи­ческой пробы (для одновременного заражения птиц иммунной и неиммунной групп).

Титрование вируса.Обычно проводят на КЭ, культурах клеток по общепринятой ме­тодике и на 6-10 нед цыплятах. Доза инокуляции вируса для цыплят 0,5 мл (внутримышечно или внутривенно). Срок наблюдения 15 дн.