Индикация и идентификация вируса

Вирусоскопия не проводится.

Электронно-микроскопическая диагностика. Метод электронной микроскопии позволяет обнаружить вирус болезни Ауески че­рез сутки после экспериментального заражения в мазках-отпечатках, кото­рые готовят непосредственно на электронно-микроскопических сеточках со слизистой оболочки глаза, носа, ротовой полости и из мочи.

Обнаружение специфических телец-включений. Это вспомогательный метод идентификации вируса. Внутриядерные тельца-включения обнаруживают в препаратах из зараженной культуры клеток, окрашенных гематоксилин-эозином, а также при электронной микроскопии, в случае типичного ЦПД, культуры клеток куриного эмбриона и почки свиньи.

Серологическая идентификация. Для идентификации вируса болезни Ауески используют в основном РН в культуре клеток или на кроликах, ме­тод флюоресцирующих антител. РДП, РНГА, ELISA-метод и др. Кроме того, для этой цели можно использовать РСК, однако из-за нестандарт­ности антигена и непостоянства результатов самой реакции она не нашла широкого применения.

РН. Удобный и надежный метод идентификации выделенного вируса. Используют культуру клеток того же вида, на которой был изолирован ви­рус. Реакцию ставят по общепринятой методике, чаще используют вариант: различные разведения вируса (10 ^-1-10^-7) и постоянную дозу сыворотки. Перед постановкой реакции культуральный вирус размораживают, цент­рифугируют в течение 30 мин при 2-3 тыс. об/мин и в реакции использу­ют надосадочную жидкость. Положительную и отрицательную сыворотки разводят 1:10 питательной средой для культуры клеток, содержащей ан­тибиотики, и прогревают при 56 °С 30 мин. Результаты РН учитывают по ЦПД через 2-5 сут. Вирус считают идентифицированным, если индекс-нейтрализации составляет 2lg и выше.

Для РН могут быть использованы и кролики. Методика постановки РН на них заключается в том, что 0,1 мл суспензии вируса (суспензия моз­га и селезенки кролика, погибшего после заражения вирусом, разведенная 1:50 поддерживающей средой или раствором Хенкса) смешивают с 2 мл сыворотки крови, взятой от 2-3 переболевших свиней. Смесь тщательно встряхивают и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 2 ч, после чего вводят подкожно двум кроликам. Параллельно ставят контроль, при­бавляя такое же количество вирусной суспензии к 2 мл нормальной сыво­ротки крови свиней, с последующим выдерживанием в термостате и ино­куляцией двум кроликам. Кролики, которым введена смесь вируса с иммун­ной сывороткой, остаются здоровыми, а контрольные погибают через 60-72 ч после инокуляции при наличии характерных признаков болезни Ауес­ки. 1 мл сыворотки переболевших свиней, полученной через 4 нед после выздоровления, может нейтрализовать 25 кроличьих ЛД_5О вируса.

Приготовление гипериммунной сыворотки для РН. Ее получают от 2-3 свиней, переболевших болезнью Ауески, через 4 нед после выздоровления. Гипериммунные сыворотки готовят путем инокуляции взрослых свиней, ко­торым с 2-недельным интервалом подкожно вводят вирус в нарастающих дозах (50 и 100 мл) с последующей инъекцией двух таких же доз внутри­венно. Кровь для получения сыворотки берут через 2 нед после последней иммунизации. Полученная сыворотка в разведении 1:90 нейтрализует от 1000 до 3160 ТЦД₅₀ вируса.

Кроликов использовать для получения антисывороток нельзя, так как они очень чувствительны к вирусу Ауески.

Сыворотки крови от здоровых и переболевших животных сохраняют до использования в замороженном состоянии (минус 20-30°С). Перед поста­новкой реакции их размораживают, инактивируют прогреванием в водяной бане при 56 Т. в течение 30 мин. после чего готовят серийные двукратные разведения от 1:2 до 1:256 (при постановке реакции в культуре ткани с постоянной дозой вируса), используя в качестве разбавителя поддержи­вающую среду. При идентификации вируса используют гипериммунную сыворотку в разведении 1:5. При постановке реакции на кроликах использу­ют неразведенную сыворотку от переболевших животных.

РИФ. Используют для быстрой индикации и идентификации антигена вируса Ауески в клетках культур ткани. инфицированных материалом, содержащим вирус, а также в замо­роженных срезах ткани мозга кроликов, зараженных суспензией патологи­ческого материала, или поросят, заболевших в естественных условиях.

Препараты готовят и окрашивают по общепринятой методике. При под­готовке гистосрезов необходимо блоки толщиной 2 3 мм вырезать из раз­личных отделов головного мозга. Вскрывать трупы с целью взятия мате­риалов для иммунофлюоресцентного исследования необходимо как можно быстрее после гибели животных, так как четкие результаты будут полу­чены только при исследовании свежих образцов и замороженных в криостате или в смеси сухого льда со спиртом.

В положительных случаях в срезах мозга обнаруживают специфиче­скую флюоресценцию. В головном мозге поражаются главным образом нейроны коры. При малом увеличении можно видеть широкие полоски флюоресцирующих нейронов, в которых заметны только отдельные флюорес­цирующие клетки. В срезах мозжечка пораженные клетки распределены более беспорядочно. Часто они видны как флюоресцирующие фокусы в зернистом слое. Иногда в них оказываются вовлеченными единичные клет­ки Пуркинье, но особого аффинитета вируса к этим клеткам обычно не наблюдают.

Распределение флюоресценции внутри клеток может варьировать в ши­роких пределах. Иногда вирусный антиген обнаруживают как в цитоплаз­ме, так и в ядре, но обычно свечение ядра выражено сильнее. Часто флюо­ресцирующие массы имеют вид светящейся пыли или мелких гранул. В от­дельных случаях удается обнаружить внутриядерные включения типа А Каудри, однако более неправильной формы, чем в препаратах, фиксиро­ванных и окрашенных обычными методами. Иногда светится только ци­топлазма, причем степень свечения и характер распределения также варьи­руют. Часто обнаруживают скопление светящихся гранул вокруг ядер. В некоторых районах можно можно заметить мелкие светящиеся частицы вдоль аксонов. Для выделения вируса инфекционный материал, полученный из мозговой ткани, миндалин и селезенки животных, наносят непосредствен­но на монослой чувствительных к вирусу клеток и центрифугируют 40-60 мин при 1500 g. Затем инокулят заменяют питательной средой, а ин­фицированные клетки инкубируют в термостате в течение 12-14 ч. После фиксации препараты обрабатывают конъюгатом моноклональных антител с флюоресциином и исследуют в люминесцентном микроскопе.

Результаты иммунофлюоресцентного исследования хорошо согласуются с данными биопробы на кроликах и результатами выделения вируса в Культуре к теток.

РНГА. Антиген вируса болезни Ауески с помощью иммуноглобулинового варианта РНГА и РТНГА можно выявлять за 1-3 дня до появ­ления клинических признаков болезни, в период болезни и после переболевания. При приготовлении эритроцитарного иммуноглобулинового диагностикума используют гипериммунную сыворотку свиней и крыс с вируснейтрализующим титром 11,5 и 11,0 log₂ соответственно. Данная реакция имеет преимущества перед РН.

РДП. Реакцию с успехом применяют для идентификации вируса, репродуцированного в культуре клеток. Получены обнадеживающие резуль­таты при исследовании полевого материала микрометодом РДП.

РИЭФ. Это ускоренный метод распознавания антигенов. Антиген вируса болезни Ауески в электрополе движется к аноду, антитела — к ка­тоду, и ни месте встречи их образуется линия преципитации. Время появле­ния полос зависит от напряжения тока. РИЭФ значительно чувствительнее и протекает в 10-15 раз быстрее, чем обычная РДП.

РСК. Данная реакция не нашла широкого применения, так кик по­ложительные результаты получаются только при использовании специаль­ного метода изготовления антигена.

Иммуноферментная идентификация вируса. Можно быстро идентифицировать вирус прямым иммунопероксидазным методом. Антисыворотку к вирусу для мечения ферментом получают на поросятах
6-месячного возраста, которых вначале заражают интраназально в дозе
10^3,3 ТЦД₅₀, а через 12 нед вводят внутримышечно в 4 участка тела частич­но очищенный вирус, смешанный с полным адъювантом Фрейнда. Через 9 дней инъекцию повторяют. Иммунопероксидазный метод по чувствитель­ности равен иммунофлюоресцентному, превосходит метод выделения вируса в культуре клеток.

При окрашивании прямым иммунопероксидазным методом в мазках-от­печатках обнаруживали клетки, содержащие антиген вируса в виде крас­но-коричневых гранул в цитоплазме и ядре нейронов мозга и в эпителии слизистой оболочки фаренгиальной области. Эндогенная пероксидазная ак­тивность была небольшой в мазках из мозга и значительной в фаренгиальных препаратах за счет воспалительных клеток и эритроцитов. Фиксированные препараты-отпечатки из мозга и фарингса выдерживают, хра­нение при комнатной температуре в течение 144 ч, что важно при транс­портировке материала в лабораторию.

Метод рестрикциионного анализа и гибридизации. Разработана экспресс-диагностика болезни Ауески у свиней с помощью специфических гибридизационных зондов. Предложен метод точечной гиб­ридизации (ДНК-зонда) для выявления вируса в материалах из органов свиней. Данный метод позволит выявлять геном вируса при латентной инфекции. Гибридизационные зонды, основан­ные на применении рекомбинантной ДНК, позволяют обнаруживать вирус­ный геном в костном мозге (50%), макрофагах, лимфоцитах и тимусе (20%) зараженных поросят.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. В настоящее время практические специалисты и научные работники склонны считать, что ме­тод серологической проверки животных с выбраковкой положительно реа­гирующих и последующими перепроверками является более успешным и эффективным в борьбе с болезнью Ауески, чем вакцинация. С вакцинацией связан ряд проблем. Однако с помощью серологических реакций нельзя отличить естественно инфицированных животных от вакцинированных.

Диагноз на инфекцию ставят обычно при помощи РН в культуре клеток, определяя титры вируснейтрализующих антител к вирусу Ауески в сыворотках крови реконваленсцентов.

Для серологического исследования животных берут не менее 5 мл кро­ви. Сыворотку получают методом отстоя, хранить ее можно до 10 сут при 4°С. При длительном хранении следует заморозить.

Для более точной диагностики лучше исследовать парные сыворотки, взятые с интервалом в 3-4 нед. Титры антител у переболевших животных могут колебаться в широких пределах - от 1:32 до 1:256. У поросят и подсвинков, зараженных вирусом Ауески, специфические вируснейтрализующие антитела появляются к 6-8-му дню после заражения, достигая макси­мума через 3-4 нед. Через 100 дней после заряжения титры вируснейтра­лизующих антител начинают снижаться, а через 135 дней антител уже обычно не находят. У естественно больных и переболевших подсвинков вируснейтрализующие антитела удается установить примерно в те же сроки, хотя в сыворотках переболевших свиней их иногда удается обнаруживать в течение 4,5 лет. Антитела также находят и у свиней, перенесших бессимп­томную инфекцию.

Динамика вируснейтрализующих антител у животных других видов изу­чена недостаточно.

Характерным является увеличение титра антител у свиноматок непо­средственно перед опоросом: новорожденные поросята получают антитела от матерей.

Для обнаружения и титрования антител, кроме РН, применяют РНГА, РДП, РСК, ELISA-метод и ряд других реакций.

РН. В культуре клеток ставят с постоянной дозой вируса (1000 ТЦД₅₀/0,1 мл) и разными разведениями сыворотки (от 1:2 до 1:16) по общепринятой методике. Для контроля благополучного стада допускается исследование групповых сывороток от 5 животных. Сыворотки перед по­становкой реакции инактивируют при 56 °С в течение 30 мин. Результаты РН считают положительными при отсутствии цитопатического действия в разведениях сыворотки 1:2 и выше при дозе вируса 1000 ТЦД₅₀/0,1 мл. Наличие специфических антител в испытуемых сыворотках крови свидетельствует и возможном инфицировании животных или вакцинации их против болезни Ауески; положительный результат исследования сывороток кро­ви невакцинированных животных — о подозрении на болезнь, что под­тверждают постановкой биологической пробы. Предложен микрометод РН для диагностики болезни Ауески.

Для выявления животных, инфицированных вирусом болезни Ауески в естественных условиях, РН более надежна, чем вирусологическое иссле­дование смывов полости рта и глотки.

Наибольшей чувствительностью обладает метод постановки РН в куль­туре клеток Vero со штаммом Phylaxia.

Приготовление антигена для РН. В качестве антигена для постановки реакции нейтрализации в культуре клеток используют вирус с предвари­тельно определенной активностью (10^6,5-10^7,5 ТЦД₅о/мл. Для сохранения активности вирус хранят замороженным при минус 30°С. Если его выращи­вают на бессывороточной среде, то для лучшей сохраняемости к культуральной жидкости перед замораживанием можно добавить 2% нормальной сыворотки крови теленка. Перед постановкой реакции культуральнын вирус размораживают, центрифугируют в течение 30 мин при 2500-3000 об/мин, после чего надосадочную жидкость собирают и в соответствии с титром вирусного материала разводят - до содержания 100-1000 ТЦД₅о/0,1 мл.

Для постановки РН на кроликах обычно используют суспензию (1:50) головного мозга и селезенки кролика, погибшего после биопробы, при на­личии симптомов болезни, характерных для болезни Ауески.

РНГА. Успешно применяют ее для выявления специфических антител в молозиве, молоке и сыворотках крови животных к вирусу болез­ни Ауески. Пробы молока и молозива автор брал в течение недели после опороса свиноматок и консервировал их 1%-ным раствором борной кислоты. Сыворотку молока и молозива перед реакцией инактивировал при 56°С 30 мин. Для изготовления эритроцитарного диагностикума наиболее пригоден концентрированный культуральный вирус с титром 8,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Некоторые авторы считают, что РН менее чувствительна, чем РНГА; с помощью РН антитела на ранней стадии болезни не выявлялись, их об­наруживали лишь с 12-го дня, тогда как РНГА регистрировала их нали­чие на 5-й день.

РДП.После концентрации и очистки вируса с помощью химических детергентов (20%-ный дезоксихокат натрия, 20%-ный) тритон-Х, 1%-ный β-меркаптоэтанол) получают антигенную фракцию, которая реагирует в ага­ровом геле с сыворотками в титре 1 : 4 в 100% случаев.

ELISA-метод. Он в 60-100 раз более чувствителен, чем РН. Ан­титела в ELISA обнаруживают на 5-6-й день после заражения, в РН — на 9-10-й. Иммуноглобулины классов G и М определяют в ELISA с 5-го дня после инокуляции вируса, причем максимум титров IgM приходился на 9-10-с сутки, a IgG- на 10-15-е сутки.

ELISA-метод вполне может быть использован вместо РН для диагно­стики болезни при условии наличия соответствующего оборудования и вы­сококачественных диагностических наборов. С помощью данного теста мож­но проводить регулярные обследования.

Для определения у свиней антител к вирусу болезни Ауески рекомен­дуется использовать микрометод. Антиген готовят из культуры клеток РК-15, зараженной полевым штаммом вируса. Через 48 ч инкубирования зараженные клетки культуры разрушают замораживанием, оттаиванием и дополнительно ультразвуком, а затем концентрируют в 30 раз ультрацент­рифугированием. Антиген в трисбуфере с рН 9,6 адсорбируют в течение ночи при 4 °С в луночках микропанели. После этого луночки промывают, вносят пробы испытываемых сывороток в разведении 1:160 в твин-20-фосфатно-буферном растворе и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Фиксацию антител на антигене определяют добавлением антисвиных кро­личьих глобулинов, меченных пероксидазой, разведенной в твин-20-фосфатном буферном растворе 1:10000. Количество связанной пероксидазы опре­деляют в реакции с ортофенилендиамином в присутствии перекиси водоро­да в цитрат-фосфатном буфере с рН 5 при комнатной температуре. Реакцию прекращают через 15 мин добавлением 50 мкл 2NH₂SO₄.

Метод ELISA оказался более чувствительным и быстро выполнимым тестом, чем РН в культуре клеток. После ультрафиолетового облучения лу­ночки с иммуносорбентом можно хранить при 4 °С длительное время.

Можно титрование антител осуществлять этим методом, но при этом применять лишь один препарат — стафилококковый белок А, меченный пероксидазой хрена. Последний дает возможность избавиться от применения антивидового препарата, меченного ферментом.

Для упрощения определения антител к вирусу болезни Ауески предло­жено использовать бумажные фильтры, которые пропитывают испытуемым образцом крови, высушивают и хранят до проведения индикации. Послед­няя проводится стандартным иммуноферментным методом ELISA. Специ­фичность данного метода составляет 100%, чувствительность — 90-96%.

РРИД. Антитела к вирусу болезни Ауески могут быть определены в течение одной ночи ферментной радиальной иммунодиффузией. Титры ан­тител определяют визуально по окрашенным круговым зонам, диаметр ко­торых (в мм) пересчитывается на соответствующие значения титров. Описа­на техника исполнения теста: неинфекционный антиген вируса болезни Ауес­ки наслаивают на поверхность чашки и покрывают агаром. В лунки добав­ляют исследуемые сыворотки, и антитела диффундируют через слой агара. Происходит специфическое связывание с антигеном. После контакта в те­чение ночи агар вынимают, отмыванием удаляют несвязанные неспецифиче­ские антитела, добавляют конъюгат (видоспецифичный, связанный с фер­ментом аптииммуноглобулин), он прикрепляется к связанным антителам. Добавление агара с субстратом и катализатором (Н₂О₂) приводит к реак­ции между ферментом в конъюгате и этим субстратом, в результате чего получается кольцо. Диаметр его (в мм) соответствует определенному количеству антител в сыворотке. При обнаружении антител у вакцинированных свиноматок чувствительность была 92%, пассивных антител у новорожденных поросят – 76%, зараженных полевым штаммом – 99%.

 

Лабораторная диагностика инфекционного ларинготрахеита кур

 

Инфекционный ларинготрахеит кур (ИЛТ) – вирусная контагиозная респираторная болезнь, поражающая кур (всех возрастов), индеек, фазанов.

Вирус инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ) птиц относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, к роду Varicellavirus. Вирус впервые выделил Бичь в 1930 г. в США. Штаммы вируса ИЛТ различаются по вирулентности для птиц и КЭ, тропизму, скорости выделения из клеток в тканевой культуре, устойчивости при хранении, молекулярно-структурными особенностями. Иммунологических различий среди штаммов вируса ИЛТ не обнаружено. В организме кур вирус ИЛТ индуцирует образование ВНА.

Впервые описан в 1925 г. Мей и Титслер под названием инфекционный бронхит. С 1931 г. её стали именовать инфекционным ларинготрахеитом. Регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков болезни (расстройство акта дыхания, кашель, удушье, поражение глаз, откашливание слизи с примесью крови), патологоанатомических изменений (геморрагическое и катаральное воспаления слизистой оболочки гортани и трахеи, фибринозные массы в конъюнктивалыюм мешке, казеозные пробки в просвете гортани) и результатов лабораторных исследований. Часто болезнь протекает атипично, характерные признаки ее слабо выражены или их нет. В таких случаях решающее значе­ние в диагностике приобретают лабораторные методы исследования.

Выделение вируса.Для вирусологического ис­следования от больных птиц берут экссудат из трахеи, от павших или вынуж­денно убитых в начальной фазе болезни (между 2-7 днями) — слизистые оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы, носовых ходов и кусочки легких. Ма­териал замораживают и сохраняют при минус 20°С и ниже. Для гистологи­ческих исследований материал помещают в 10%-ный раствор нейтрального формалина.

Из патологического материала готовят суспензию 1:5 на растворе Хенкса или изотоническом растворе NaCl, центрифугируют при 1500-2000 об/мин в течение 15 мин, к надосадочной жидкости добавляют по 1000 ЕД пеннциллина и 500 мкг стрептомицина в расчете на 1 мл, выдерживают в течение 3-4 ч при 2-4 °С. Затем используют для инокуляции КЭ, культуры клеток или молодых не иммунных к инфекционному ларинготрахеиту цыплят.

Заражение куриных эмбрионов. Для каждой пробы исполь­зуют по 10 эмбрионов 9-12-дневного возраста. Заражают на ХАО. Погибших в первые 24 ч после инокуляции эмбрионов не учитывают. Оставшихся живых эмбрионов на 6-8-й день убивают. Макроскопические изменения ХАО появ­ляются через 2,5-3 сут и достигают максимума к 5-6-му дню. Штаммы ви­руса инфекционного ларинготрахеита вызывают мелкоузелковые и очаговые поражения хорионаллантоиса. Узелковые поражения обнаруживаются по всей поверхности хорионалантоиса, очаговые — только па месте инокуляции ви­руса. Необходимо учитывать, что не все штаммы вызывают гибель куриных эмбрионов на 4-6-й день. Для выявления специфических поражений необхо­димо проведение не менее трех пассажей, используя ХЛО, суспендированную в аллантоисной жидкости предыдущего пассажа.

Выделение вируса надо подтвердить обнаружением телец-включений Зейфрида, РП, РДП, биопробой, а также РИФ и электронной микроскопией.

Заражение культур клеток. Наиболее пригодны в данном случаe культуры клеток почек эмбриона и цыплят, в которых первые изменения наблюдаются иногда уже через 24 ч после заражения, а через 48-72 ч в клеточной культуре обнаруживаются многоядерные гигантские клетки, в ко­торых можно обнаружить внутриядерные включения. Специфичность этих из­менений доказывают в РИФ или РН. Наблюдение за культурой клеток проводят до 6-7 дней.

Индикация и идентификация вируса.Обнаружение специфических телец-включений. Вирус инфекционного ларингограхеита размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки гортани, трахеи, клоаки, вызывая острое воспаление этих обо­лочек с образованием внутриядерных включений. Включения обнаруживаются до наступления некроза эпителия между первым п пятым днями после интрахеального заражения цыплят. В мазках из конъюнктивы включения нахо­дят через 48 ч после заражения. Ядро, содержащее включение, обычно увели­чено, отмечается гиперхромация ядерной оболочки. Включения имеют округ­лую форму, иногда форму диплококков и занимают ¹/₂ - ²/₃ клеточного ядра. Вокруг включения видим неокрашенная зона, что считается характерным. Болезнь можно диагностировать на основании обнаружения внутриядерных включений. Для этого на предметных стеклах готовят мазки из соскобов эпи­телия слизистой оболочки, фиксируют в абсолютном метиловом спирте в тече­ние 3-5 мин, окрашивают раствором краски Гимза (1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды) в течение 2 ч при 37 °С. затем мазки промывают, обрабатывают абсолютным метиловым спиртом, снова промывают, высушива­ют н просматривают. В положительных случаях цитоплазма эпителиальных клеток окрашивается в бледно-голубой цвет, ядерные оболочки таких клеток более темные, внутриядерные включения четко видны, светло-красного цвета, по форме варьируют (шарообразные или колбасовидные), окружены ясно ви­димыми светлыми ободками. Количество их в ядре от 1 до 4. Указанный ме­тод позволяет иногда в течение 3 4 ч диагностировать инфекционный ларинготрахеит даже при атипичном проявлении. Вероятность обнаружения телец-включений в патологическом материале существует только в начальной фазе болезни — между 2-м и 7-м днями.

РИФ. Данный метод позволяет обнаружить вирусный антиген при по­мощи специфической флюоресцирующей сыворотки в мазках из слизистой обо­лочки трахеи, конъюнктивы от больных цыплят (в период острого течения бо­лезни), из пораженной ХАО п инфицированных культур клеток. Реакцию ста­вят по общепринятой методике. Чаще используют прямой метод. Положитель­ную флюоресценцию в мазках от больной птицы наблюдают в период острого течения болезни, когда обнаруживаются внутриядерные включения и можно выделить вирус на эмбрионах кур.

Биопроба.Ставят ее на цыплятах 30-90-дневного возраста путем аппликации вируссодержащего материала на слизистую оболочку гортани, тра­хеи, глаз, носа, подглазничного синуса, клоаки. При наличии вируса в иссле­дуемом материале у зараженных цыплят на 6-12-и день развиваются типич­ные клинические признаки экспериментальной инфекции При инокуляции материала в подглазничный синус в положительных случаях развивается сину­сит с отеком, выделениями из носовых ходов и слезотечением. Положитель­ная реакция на клоачную пробу проявляется с 3-го по 8-й день, но чаще — на 4-5-й день в виде отечности слизистой оболочки фабрициевой сумки и ката­рального, геморрагического или фибринозного воспаления.

Наблюдение за зараженными цыплятами ведут до 14 дней. Чаще всего заражение цыплят проводят на слизистую оболочку трахеи и клоаки, так как этот метод позволяет определить вирулентность штамма, а также провести дифференциацию его от вирусов, вызывающих сходное поражение ХАО у ин­фицированных куриных эмбрионов. При ннтратрахеальном заражении 4-недельных цыплят вирулентным штаммом инфекционного ларинготрахеита CS-1 наибольший титр вируса в тканях трахеи (10^й БОЕ/г) установлен на 2-4-е сутки. Позднее количество вируса резко снижалось, и на 7-й день его не обнаруживали, хотя антиген вируса в эпителии трахеи в большом количе­стве выявляли на 7-е и 8-е сутки с помощью флюоресцирующих антител.

Последнее время естественные инфекции все чаще протекают в нетипичной, хронической или безсимптомной формах. Выделяемые штаммы также менее патогенны для куриных эмбрионов, не всегда приводят к их гибели и даже не всегда вызывают патологические изменения на слизи­стых оболочках при непосредственном введении исследуемого материала.

РН на куриных эмбрионах. Реакцию ставят по общепринятой методике. Чаще всего в диагностической практике используют метод: разведе­ние вируса и постоянная доза сыворотки. Результаты РН выражают в индек­сах нейтрализации. Принято индексы нейтрализации от 1 до 9 считать отри­цательными от 10 до 49 — сомнительными, от 50 и выше — положительными. РН можно проводить и на культурах клеток почек куриного эмбриона и 3-8-дневных цыплят.

РДП. Для идентификации возбудителя в РДП используют набор куриных антисывороток, полученных к различным вирусам птиц. РДП ставят по общепринятой методике. Согласно стандарту для РДП при диагностике инфекционного ларинготрахеита птиц 1,5%-ный агаровый гель готовят на вероналовом буферном растворе с рН 7,2. который готовят следующим образом: в 100 мл горячей дистиллированной воды растворяют 1,84 г веронала, после охлаждения доливают дистиллированной водой до 1000 мл и растворяют в полученном растворе 10,3 г мединала. Раствор хранят при 4 °С.

В среднюю лунку помещают исследуемый антиген, а в периферийные лунки — гипериммунные преципитируюшие сыворотки. Специфические линии преципитации появляются через 24 - 48 ч, однако в некоторых случаях они появляются к 72 ч и располагаются между средней линией и лункой, содержащей сыворотку.

Реакция проста по технике выполнения и позволяет выявлять примерно 75% положительных случаев, установленных при помощи заражения эмбрионов.­

РДП специфична, но недостаточно чувствительна, ее используют главным образом для ретроспективной диагностики среди взрослых кур.

Приготовление гипериммунных сывороток и антигенов. Гипериммунные вируснейтрализующие сыворотки получают на кроликах по следующей схеме: виру (суспензии хорионаллантоисных оболочек 1:10 после центрифугирова­ния при 2500 об/мин в течение 30 мин) вводят кроликам внутривенно в тече­ние 3 лед по 3 раза в неделю (через день) в первую неделю — по 2 мл, во вто­рую — по 3, в третью — по 4 мл. Через 7 нед после первичной иммунизации кролику внутрибрюшинно инъецируют 10 мл вируса, а на следующий день — кролику внутрибрюшинно инъецируют 15 мл внутривенно. Через 7 дней после последнего введения антигена кроли­ков обескровливают. Гипериммунные кроличьи сыворотки используют в РН для типирования вируса инфекционного ларинготрахеита.

Получение гипериммунных преципитирующих сывороток на птице. Цент­рифугированную суспензию хорионаллантоисной оболочки в разведении 1:10 вводят взрослым петухам в подкрыльцовую вену в объеме 1-2 мл по схеме четыре инъекции с промежутками в один день; 7 дней отдыха; четыре инъек­ции с промежутками в один день. На 6-й день после последней инъекции проб­но берут кровь из сердца; в случае неактивности сыворотки проводят трех­кратное введение вируса с суточными интервалами; на 6-й день вторично бе­рут пробу крови.

Идентификация вируса с помощью моноклинальных антител. По чувствительности ИФЛ-тест с моноклональпымн антителами сопоставим с методом выделения вируса, но более быстрым и более чувствительным по сравнению с иммунофлюоресценцией.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. В нетипичных случаях, особенно при хроническом течении инфекции, провести диагностику позволяет установление роста титра антител при исследовании парных сывороток. Одна­ко такого рода исследования проводятся главным образом с целью получения данных, свидетельствующих о перенесении заболевания данной популяцией и указывающих на степень распространенности возбудителя на определенной территории.

Пробы сыворотки от птицы исследуют дважды — через 14-28-дневный интервал. Повышение титра антител к вирусу и числа положительно реаги­рующих птиц в стаде свидетельствует о наличии и распространении инфекции в хозяйстве, а сохранение или снижение уровня антител — о прошедшей ин­фекции.

Для серологического исследования кровь берут на 14-й и 28-й дни от на­чала болезни не менее чем от 5-10 птиц по 5 мл от каждой. До начала исследования сыворотку сохраняют в замороженном состоянии при минус 20-70°С. Сыворотки (больных и переболевших птиц, а также контрольные) инактивируют при 56°С 30 мин.

Приготовление антигенов для РН и РДП. Хорионаллантоисные оболочки куриных эмбрионов с характерными для данного вируса поражениями гомоге­низируют с равным количеством буферного изотонического раствора с рН 7,2-7,4, к которому добавлены антибиотики из расчета по 100 ЕД пеницил­лина и стрептомицина на 1 мл раствора. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин. Надосадочную жидкость сливают и используют в качест­ве антигена, если она содержит вируса не менее
10-⁵ ЭИД₅₀/мл. Антиген со­храняют в замороженном состоянии.

Предложена следующая методика концентрации и очистки вируса: вируссодержащий материал концентрируют полиэтиленгликолем с мол. массой 6000; конечная концентрация его в вируссодержащей суспензии равна 7%; концент­рирование ведут при 4°С в течение 3 ч, центрифугируют концентрированный вирус при 3000 об/мни 30 мин. Инфекционная активность полученного вируса 10^-6-10⁷ ЭИД₅₀/мл.

РН. На куриных эмбрионах или культурах клеток ставят по общеприня­той методике, чаще используют модификацию: постоянная доза сыворотки и различные разведения вируса. Число рядов соответствует числу испытуемых сывороток плюс два ряда контроля (с нормальной и иммунной сыворотками), а число пробирок в ряду — числу разведений вируса. После контакта (I ч при комнатной температуре) смесь сыворотки с каждым разведением вируса инокулируют не менее чем четырем куриным эмбрионам на ХАО по 0,2 мл. Эм­брионы инкубируют при 37°С в течение 6 дней. При вскрытии выявляют спе­цифические изменения на ХАО. В РН рекомендуется использовать неразведен­ные сыворотки. Оценку результатов реакции проводят по индексу нейтрали­зации. Сыворотку с индексом нейтрализации 10 или меньше считают отрица­тельной, а с индексом больше 10 — положительной.

РДП. Проводят по общепринятой методике, используя стандартный ан­тиген. Эта реакция может выявить 25-50% переболевших птиц. Однако про­стая техника постановки ее и быстрое получение результатов дают возмож­ность с минимальными затратами средств и времени обследовать большое количество птицы.