Выделение и идентификация кампилобактерии

Культивирование. Кампилобактерии являются микроаэрофилами будучи по типу дыхания аэробами, они требуют в то же время пониженного содержания в атмосфере молекулярного кислорода (5-10% — микроаэрофильность) и повышенного СО₂ (1-10% — капнофильность). Не­обходимый состав газовой среды получают следующими способами.

Пробирки, чашки Петри с посевами помещают в анаэростат, отка­чивают 2/3 воздуха (следят по манометру), затем добавляют углекислоту до отметки 0,5.

Из микроанаэростата с посевами удаляют 2/3 воздуха, затем восста­навливают обычное атмосферное давление, вводя газовую смесь из 90% азота и 10% углекислого газа. Конечная газовая смесь содержит 6% кисло­рода, 6% углекислого газа и 88% азота.

Чашки Петри с посевами помещают в герметичные полиэтиленовые пакеты, которые заполняют из баллона газовой смесью (азот — 85%, угле­кислый газ — 10%, кислород — 5%). Пакет сжимают, удаляя газовую смесь, и вновь заполняют ею, процедуру повторяют двукратно, после чего пакет заклеивают липкой лентой.

Используют газогенераторные пакеты. В герметично закрывающийся сосуд (микроанаэростат, эксикатор) помещают чашки Петри с посевами. Увлажненные газпакеты и сосуды закрывают. Могут быть использованы пакеты фирм BBL (Campy Pak 2) Oxoid.

В эксикатор с посевами помещают зажженную свечу, закрывают его. После затухания свечи газовый состав в сосуде составляет: азот — 90%, углекислый газ — 3%, кислород — 17%. Чистые культуры кампило­бактерии в этих условиях растут недостаточно хорошо.

Микроаэрофильные условия также достигаются посевом материала (культур) в ПЖА (0,15-0,2%) и среду СЖН, налитые в бактериологичес­кие пробирки высоким столбиком. По высоте столбика питательной среды имеется градиент концентрации кислорода. Пробирки с посевами помеща­ют в анаэростат с заменой 10-15% объема углекислотой. Кампилобакте­рии растут в оптимальной для себя микроаэрофильной зоне.

Материал, поступающий для бактериологического исследования, обычно контаминирован посторонней микрофлорой. При исследовании спермы (сек­рета), цервикальной слизи, препуциальных смывов их центрифугируют 10 ми­нут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость высевают непосредственно на питательные среды или подвергают фильтрова] шю через мембранные фильтры, благодаря чему задерживаются грибы, крупные бактерии. Проходят толь­ко мелкие бактерии размером 0,2-0,5 мкм, в том числе кампилобактерии. Предназначенный для этого смонтированный фильтр Зейтца и колбу Бунзена стерилизуют в автоклаве, мембранные фильтры № 2 и № 5 кипятят в дистилли­рованной воде 10 минут со сменой воды. В стерильных условиях мембранные фильтры закладывают в фильтры Зейтца в последовательности № 5 — № 2 — № 5. Фильтрат засевают на питательные среды.

При исследовании абортированных плодов посевы делают из содержи­мого сычуга, легких, печени, головного мозга, амниотической жидкости, из­мененных участков плаценты. На ПЖА высевают по 0,5 мл содержимого желудка, двенадцатиперстной кишки, околоплодных вод и желчи. Кусочки селезенки, печени, котиледонов, мозга и легких растирают в ступке и высе­вают отдельно из каждого органа на 3-4 пробирки с ПЖА и три чашки плотной среды. Также можно производить посевы пастеровскими пипетками. Посев материала на ПЖА прово­дят пастеровской пипеткой на дно, перенося после перемешивания часть ма­териала аналогичным путем последовательно еще в четыре пробирки.

При исследовании на генитальный кампилобактериоз посев целесооб­разно производить на полужидкий агар ВГНКИ, 0,15% ПЖА с 10% дефибринированной крови или сыворотки крови, на 2%-ный мясо-печеночный пептонный агар, агар Мартена. Вместо мясной воды при изготовлении ука­занных сред используют экстракт мышцы сердца крупного рогатого скота, обогащают их кровью крупного рогатого скота, овец, кроликов (5-10%), сывороткой крови лошади (10%), экстрактом сухих дрожжей (5 г/1000 мл), а также добавляют тиогликолат натрия (0,5 г/1000 мл).

Посев загрязненного материала, кроме перечисленных питательных сред, делают на среды с селективными свойствами: плотную среду ВИЭВ, среду СЖН, оптимальные плотные питательные сре­ды с селективной добавкой Скирроу, собственно среду Скирроу или другие селективные среды. В среду СЖН материал засевают в 5 пробирок, как и в пробирки с ПЖА. Чашки Петри, пробирки с посевами инкубируют при 37°С 4-10 дней в атмосфере с6%> кислорода, 10% углекислого газа, 84% азота, просматри­вая посевы каждые 3 дня.

Смешанные культуры кампилобактерии дробно рассевают (без фильт­рации, с фильтрацией) на плотные питательные среды в чашках Петри с целью получения изолированных колоний или заражают такими культура­ми беременных морских свинок. В последнем случае 0,5 мл смешанной куль­туры вводят внутрибрюшинно или интравагинально морским свинкам. Если в течение 10-12 дней аборт не происходит, свинок убивают и делают посе­вы из полости матки и эмбрионов.

Для выделения С. fetus из содержимого кишечника рекомендуется 5 г фекалий развести в 50 мл бульона, для удаления крупных частиц профиль тровать через марлю, затем фильтр из стеклянной ваты и мембранный фильтр с порами 0,65 мкм. Фильтрат высевают в чашки Петри с агаром для бруцелл, содержащим бацитрацин (2 ед/мл) и новобиоцин
(2 мкг/мл). Посевы инкубируют при 37° С в течение 4-5 суток в атмосфере с 5% 0₂,10% С0₂ и |5% N₂.

С целью выделения культур кишечных кампилобактерии из фекалий со­держимое кишечника в количестве 1 г разводят 1:10 физиологическим ра­створом. Исследуемую взвесь центрифугируют, как описано выше, надосадочную жидкость пропускают через нестерильные мембранные фильтры с диаметром пор 8 и 1,2 мкм, а затем через стерильные фильтры с порами 0,65 мкм. Несколько капель фильтрата высевают на кровяной или «шоколад­ный» агар и культивируют в условиях соответствующей газовой атмосфе­ры. Возможен упрощенный вариант фильтрации. В этом случае на поверхность плотной неселективной питательной среды (кровяной агар) помещают мембранный фильтр с диаметром пор 0,65 мкм, на него наносят несколько капель исследуемого материала, через некоторое время фильтр удаляют и чашки Петри подвергают инкубированию. Другим вари­антом изоляции кампилобактерии из фекалий является посев материала в жидкие обогатительные питательные среды (среда Престон, Уотермана, Дойля, Campy-Thio и др.) или плотные среды с селективными добавками (среды Скирроу, Бутцлера, Campy-ВАР, Престон).

Материал, находящийся в транспортных средах, допускается выдер­живать в холодильнике до 24 часов. Если посев может быть произведен непосредственно после поступления материала в лабораторию, то его вы­держивание в холодильнике нецелесообразно. Метод фильтрации, при низком содержании в материале кампилобактерии, несколько снижает чув­ствительность исследования. Из отечественных пита­тельных сред для первичной изоляции кампилобактерии в качестве осно­вы рекомендуется эритрит агар Дагестанского НИИ с 5%-ной лизированной дистиллированной водой крови барана. Для придания селективных свойств в расплавленную среду предварительно вносят рифампицин — 10 мкг/мл, амфотерицин В — 2 мкг/мл, полимиксин В — 2 мкг/мл, ристомицин —
10 мкг/мл. Помимо эрит­рит агара, сред Скирроу, Престон может быть использован бруцелла-агар с 5% крови овцы, ванкомицина — 10 мкг/мл, полимиксина В сульфата — 2-5 ЕД/мл, триметаприм лактата — 5 мкг/мл, цефалотина — 15 мкг/мл, амфотерицина В — 2 мкг/мл.

Посевы с целью выделения инкубируют при 42-48°С в течение 2-
3 суток, что обеспечивает угнетение роста многих энтеробактерий.

Для изоляции С. mukosalis (возбудитель кишечного аденоматоза сви­ней) пораженную ткань кишечника гомогенезируют и засевают на кровя­ной агар, лучше с бриллиантовым зеленым (1:60 000). Первичные посевы инкубируют в анаэробных условиях при 37°С 3-5 суток. В последующих пассажах возбудитель хорошо растет в микроаэрофильных условиях. Для выращивания С. cryaerophila используют полужидкий агар с 5-флуораци-лом (100 мкг/мл). Температурный оптимум 30°С. Выделенные культуры поддерживают в аэробных условиях на кровяном агаре.

На ПЖА (0,15%) культуры С. fetus растут в виде серо-голубоватого кольца на глубине 1-4 мм под поверхностью среды, в 0,5%-ном ПЖА их рост более поверхностный. Культуры непатогенного вида С. mucosalis в 0,15%-ном ПЖА растут диффузно или в виде кольца под поверхностью, а в 0,5%-ном ПЖА рас­тут в виде «елочки» по уколу. На среде СЖН при росте чистой культуры кампи­лобактерий цвет среды не меняется (розовый), рост смешанной культуры или посторонней микрофлоры сопровождается ярко-желтым окрашиванием среды. Оба подвида С. fetus образуют на плотных оптимальных средах мелкие (около 1 мм) колонии, округлые, слегка приподнятые, просвечивающие, с влажной поверхностью. На плотной питательной среде ВИЭВ возбудители ге-нитального кампилобактериоза формируют изолированные, круглые, с ров­ными краями, гладкой поверхностью, полупрозрачные, с серовато-розовым оттенком колонии диаметром 1-2 мм. В принципе, возможно наличие трех типов колоний: S — с ровными краями, гладкой поверхностью, содержащие преимущественно клетки в виде запятой и летящей чайки; М — слизистые, клейкие, с трудом отделяющиеся от поверхности среды, плотные, состоят из неподвижных и слабоподвижных клеток; R-колонии — с шероховатой по­верхностью, плотные.

Наиболее частый возбудитель диарей — C.jeujni, который на среде Кери-Блер с эритрит агаром через 48 часов культивирования растет, так же как и С. fetus, в виде диска под поверхностью среды. На эритрит агаре через 2 суток образуют полупрозрачные, блестящие, влажные, плоские колонии, как бы расплывающиеся по агару. Штаммы, выделенные от животных, форми­руют оптически более плотные, вплоть до беловатого оттенка, а от человека — более нежные колонии. При наличии подозрительных колоний на плотных питательных средах и типичного для микроаэрофилов роста на полужидких средах из культур готовят мазки,

Морфология клеток кампилобактерий в культуре. В мазках из 3-5-суточных культур, выращенных на полужидких или плотных средах, преобладают длинные спирилловидные формы (С. fetus) размером 1-10x0,2-0,8 мкм. На одном или обоих концах клетки имеются жгутики. Для определения подвижности кампилобак­терий удобен следующий метод. На предметном стекле смешивают каплю культуры и каплю красителя (азур-эозин 0,1 г, кристаллвиолет — 0,1 г, ща­велевокислый аммоний — 0,5 г, этанол — 5 мл, дистиллированная вода — 120 мл, после растворения компонентов добавляют 180 мл физиологичес­кого раствора). Готовят препарат «раздавленная капля» и исследуют под иммерсионой системой микроскопа.

В 6-9-суточных культурах на плотной среде могут присутствовать клетки с колбообразными вздутиями, на недоброкачественных средах и в старых культурах много кокковидных клеток.