Выделение и идентификация возбудителя

Микроскопическое исследование исходного материала

Бактериологическое исследование

Прижизненно материал берут на острой стадии течения болезни у живот­ных с повышенной температурой, не подвергавшихся обработке антибио­тиками. Отбирают пробы крови, стерильными ватными тампонами — носо­вую слизь. В летальных случаях материал берут по возможности сразу после смерти животного: пробы трахеальнои слизи, участки пораженных Легких, перикардиальную и плевральную жидкость, сегменты тонкого ки­шечника с изменениями, субменингиальные мазки, сегменты мозга, цереб­роспинальную жидкость из латерального желудочка, фибринозный экссу­дат из пораженных суставов, лимфоузлы, регионарные урогенитальным органам. Материал доставляют в лабораторию в замороженном виде, луч­ше — при температуре ниже -60° С.

Из исследуемого материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают по Граму и на капсулы. В положительных случаях обнаруживают грамотрицательные палочковидные, вплоть до кокковидных, бактерии с капсулой.

Культивирование. Н. somnus требует для своего роста повышенного содержания С0₂ (5-10%), в обычной атмосфере не растет. Температурный оптимум 37-38° С, рН пита­тельных сред 7,8. Зависимости роста от Х- и V-ростовых факторов нет, хотя в первых пассажах возбудитель может проявлять феномен роста около штриха S.aureus на сывороточном (10%), но не «шоколадном» или кровяном агарах. Свежевыделенные штаммы не растут на общепринятых питательных средах, сывороточном, гемоглобиновом агаре, ингредиенты которого стерилизовали автоклавированием, плохо растут на «шоколадном» агаре. Оптимальной пита­тельной средой для первичной изоляции возбудителя является агар с цитрированной кровью (5-10%) крупного рогатого скота. Кровь других животных стимулирует рост Н. somnus хуже.

При незначительном содержании клеток возбудителя в исследуемом ма­териале (данные микроскопии) целесообразно параллельно делать высевы на среду обогащения — сердечно-мозговой бульон с добавками дрожжево­го экстракта, крови крупного рогатого скота или заражать в желточный мешок 7-дневные куриные эмбрионы. В случае отсутствия роста на кровя­ном агаре через 24-48 часов делают высевы со сред обогащения на кровя­ной агар.

На питательные среды целесообразно делать посев кусочками органов, в жидкие среды помещают фрагменты исследуемых тканей. На кровяной агар делают посевы в две чашки Петри, одну из которых культивируют в атмос­фере СО₂ другую — в обычной атмосфере (контроль на присутствие других видов бактерий). Посевы инкубируют в течение 48-72 часов.

На кровяном агаре через 48 часов возбудитель формирует нежные, про­зрачные, круглые, выпуклые, с гладкой поверхностью колонии диаметром 0,5-1 мм, достигающие через 72 часа 2 мм. Часть колоний (около 50%) может иметь узкую зону β-гемолиза. При длительном культивировании у колоний образуются конусовидный центр и плоская периферия, на поздних стадиях роста может появляться желтоватый пигмент. В сердечно-мозго­вом бульоне рост возбудителя проявляется незначительным помутнением среды.

Морфология клеток возбудителя в культуре. В первичных культурах возбудитель имеет склонность к полиморфизму: коккобактерии, палочки, нити. В субкультурах Н. somnus чаще представ­лен грамотрицательными палочковидными или нитевидными формами, иног­да обнаруживаются структуры неправильной формы. При микроскопичес­ком изучении колоний в агаровом блоке, окрашенном по Клинбергер-Гимза, находят длинные извилистые нити с овоидными утолщениями, а также хорошо окрашенными полярными зернами и цепи из бактерий. Клетки име­ют капсулу, жгутиков нет.

При просмотре первичных посевов обращают внимание на наличие ко­лоний с грамбтрицательными коккобактериями и палочками в чашке Пет­ри, инкубированной в аэробных условиях (это могут быть пастереллы и актинобациллы). Для исследования берут колонии бактерий, растущих толь­ко в присутствии СО₂.

Идентификация возбудителя по ферментативным свойствам. Идентификация Н. somnus, как вида с неясным систематическим поло­жением, проводится непосредственно на видовом уровне.

Для изучения ферментативных свойств отбирают колонии бактерий, ко­торые не способны расти на обычном агаре и бульоне без ростовых доба­вок, а также в отсутствие СО₂ и имеют типичные для Н. somnus культуральные, морфологические и тинкториальные признаки.

У выделенных культур исследуют каталазиую, оксидазную активность, способность к редукции нитратов, образованию индола, уреазы, лизиндекарбоксилазы, аргининдигидролазы, потребность в V- и Х-ростовых факто­рах (посев на сывороточный агар с дисками, пропита нными растворами NAD и гемина), расщепление углеводов с образованием кислоты. Ферментативные характеристики H.somnus представлены в таблице 81.