Выделение и идентификация бордетелл

Микроскопическая исследование исходного материала

Бактериологическое исследование

Объектом исследования обычно являются взятые стерильным ватным тампоном образцы носовой, трахеальной слизи, участки пораженных

легких.

Из поступившего материала готовят мазки, окрашивают по Граму. Борде­теллы, независимо от видовой принадлежности, выглядят как мелкие грам­отрицательные коккобактерии шириной 0,2-0,5 мкм, длиной 0,5-2,0 мкм; окрашиваются биполярно, располагаются одиночно, парно, редко — корот­кими цепочками. Вирулентные штаммы В. bronchiseptica имеют микрокапсу­лу. Фирма Health Gene выпускает набор для детекции возбудителя в ПЦР.

Культивирование. Бордетеллы — строгие аэробы, температурный оптимум 37-38° С, рН питательных сред 7,2-7,6. Посев исследуемого материала проводят на кровяной, сывороточной агар, агар Мак-Конки. Поскольку объектом ис­следования чаще всего является контаминированный посторонней микро­флорой материал (носовая, трахеальная слизь), то предпочтительнее посев производить на элективные среды. При этом необходимо учитывать, что при наличие в материале бактерий, расщепляющих углеводы, может тормозить рост бордетелл, так как бордетеллы требуют слабощелочных или нейтраль­ных значений среды, а контаминанты закисляют ее. Из числа элективных сред для изоляции В. bronchiseptica используют кровяной агар с клиндами-цином и неомицином, пенициллиннитрофурантоиновый агар, среду Мак-Конки, среду Smith и Baskerville с гентамицином, пенициллином, фуранта-доном (SB-среда). B.avium на SB-среде культивируют без внесения антиби­отиков. Посевы инкубируют в условиях обычной атмосферы в течение 24-48 часов.

B.bronchiseptica на кровяном (овца, лошадь) агаре формирует через 24 часа очень мелкие, выпуклые, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии, обычно с зоной β-гемолиза. В наибольшей степени гемолитичес­кая активность выражена на среде Борде-Жангу (рН 6,2-6,8). Колонии B.avium аналогичного типа, но обычно негемолитичные. На МПА свеже-выделенные культуры образуют гладкие, полупрозрачные, с блестящей по­верхностью колонии диаметром 0,2-1,5 мм, которые позднее (48-72 часа) становятся серо-белыми. В зависимости от культуральных вариаций могут быть выявлены колонии трех типов: S-форма — 1-й тип, SR-форма — 2-й тип, R-форма — 3-й тип. На агаре Гартоха колонии имеют беловатый цвет, на агаре Мак-Конки колонии мелкие, с розоватой периферией и светлым центром. На селективной среде Smith-Baskerville (SB-среда) колонии

B.bronchiseptica и В. avium через сутки инкубирования имеют размер около 0,5 мм, голубой цвет и с голубым окрашиванием среды вокруг колонии, что свидетельствует о защелочении рН в зоне роста, позднее колонии дос­тигают размера 1,5-2,0 мм. Сходные по культуральным признакам сахаролитические бактерии вызывают закисление рН, поэтому колонии и окру­жающая среда приобретают желтоватый цвет. В жидких питательных сре­дах (сывороточный МПБ) бордетеллы растут с равномерным помутнением среды, в последующем образуется осадок и пристеночное кольцо, среда становится прозрачной.

Морфология клеток бордетелл в культуре. Морфология клеток в окрашенных препаратах из культур и патологи­ческого материала сходна. Капсул не образуют. B.bronchiseptica и B.avium, в отличие от В.parapertussis и B.pertussis, имеют жгутики, поэтому обяза­тельно исследуют выделенную культуру на подвижность.

Идентификация бордетелл на уровне рода. Бактерии рода Bordetella по морфологическим и тинкториальным свойствами сходны с бруцеллами, гемофильными бактериями и вида­ми рода Alcaligenes. Для дифференциации от этих бактерий исследуют способность к росту в анаэробных условиях (гемофилы являются фа­культативными анаэробами); ферментацию углеводов (бордетеллы не закисляют среды с углеводами); потребность в никотинамиде (борде­теллы зависят от этого ростового фактора); редукцию нитратов (бор­детеллы и гемофилы всегда редуцируют нитраты); окисление амино­кислот (бордетеллы, в отличие от гемофильных бактерий, окисляют аминокислоты); редукцию тетразолия (бордетеллы, в отличие от видов рода Alcaligenes, редуцируют этот субстрат); утилизацию цитратов (В.hronchiseptica использует цитраты); защелочение лакмусового мо­лока (защелачивают бордетеллы и алкалигенес); способность к росту в питательных средах, содержащих 320 мг/л теллурита калия (борде­теллы не растут). Данные дифференцирующие признаки представлены в таблице 77.