Биопроба

Определение чувствительности к фагам. Тестируемые культуры должны быть в S-форме. Суспензию бруцелл го­товят как для РА и засевают сплошным газоном на плотную питательную среду. Тв-фаг стандартизуют в рутинном тесте разведения (RTD) и для тит­рования берут RTD и 10000xRTD. Также используют фаги репрезентатив­ных групп 1-5 Corbell и Thomas. Отдельные капли фага (~0,25 мкл) нано­сят на поверхность засеянного агара, инкубируют при 37° С, учет проводят через 24 часа и далее с этим же интервалом.

Определение уреазной активности. Рекомендуется проводить на среде Кристенсен с инкубацией при 37°С, Считывая результат через 0,5 -1 -2 -3 -4 -5 и 24 часа. На среду засевают одну бактериологическую петлю испытуемой культуры. Резуль­тат считается отрицательным, если уреазная активность не проявляется в течение 24 часов. Культуры В. suis, В. canis и В. neotomae изменяют среду В течение 15 минут. Большинство штаммов В. abortus, B. melitensis дают позитивную реакцию в интервале 1-24 часа инкубации. Культуры В. ovis — уреазонегативные.

Оксидативный метаболизм. Испытуемые культуры выращивают на сывороточно-декстрозном ага­ре 48 часов, смывают фосфатным буфером Соренсена (рН 7,0), трехкратно отмывают центрифугированием и стандартизируют до концентрации, эк­вивалентной 0,9 MrN/мл по Кьельдалю. Измерение поглощения кислорода проводят объемным респирометром с определением константы Варбурга. Поглощение кислорода выражают в виде микролитров на миллиграмм клеточного азота за час (QО2N).

Определение образования сероводорода. Испытуемую культуру бруцелл выращивают на скошенном печеноч­ном агаре в пробирках с бумажкой, пропитанной насыщенным водным ра­створом уксуснокислого свинца. Результаты учитывают через каждые два дня в течение 6 дней.

Таблица 68 - Дифференциация видов и биоваров рода Brucella

Признаки	В. abortus биовары	В. canis	В. melitensis	В. neotomae	В. ovis	В. suis
Потребность в СО2	(+)	(+)	(+)	(+)	-	-	-		-						(+)
Образование H2S	+	+	+	+	-	(-)	(+)		-	-	-	-	-	+	-	+	-	-	-
Рост в среде,   содержащей	тионин	-	-	+	-	+	+	-		-	-	-	-	-	-1	+	+	+	+	+
основной фуксин	+	-	+	+	+	+	+		+	(-)	+	+	+	-	(-)	(-)	-	+	(+)
Агглютинация моноспецифическими сыворотками	А	+	+	+	-	-	+	+		-	-	-	+	+	+	-	-	+	+	+
М	-	-	-	+	+	-	+	+	-	+	-	+	-	-	-	-	-	-	+
R	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-

+ - все штаммы положительные;
(+) - большинство штаммов положительно; (-) - большинство штаммов отрицательно; - - все штаммы отрицательны; 1) концентрация красителя 1:50 000 (масса/объем), для более четкой дифференциации биоваров 3 и 6 тионин вносят в концентрации 1:25 000, при этом биовар 3 растет, а биовар 6 - нет.

У культур бруцелл в S-форме изучают: лизис под действием бруцеллез­ного фага, окисление ряда аминокислот, углеводов, потребность в СО₂, образование H₂S, уреазы, рост в средах с тионином, основным фуксином, агглютинацию с моноспецифическими сыворотками против антигенов А, М, R.

Определение потребности культур бруцелл первых генераций в СО_2.В эксикатор (другой герметически закрывающийся сосуд) с посевами до­бавляют через газомер СО₂ до содержания 5 -10%, либо в сосуд помещают крышку чашки Петри с 0,35 г Na₂CО₃ на 1000 мл объема, в эту же крышку в наклонном положении помещают пробирку Флоринского с 0,35 мл НС1, со­суд закрывают и, наклоняя его, выливают кислоту, что обеспечивает накоп­ление необходимого количества СО₂ в емкости. Параллельно культивируют посевы в условиях обычной атмосферы. Некоторые биовары В. abortus мо­гут не требовать СО₂ уже в первой генерации.

Обычно используют следующие субстраты: а-аланин, а-аспарагин,
а-глу­таминовая кислота, а-аргинин, Da-цитруллин, Da-орнитин, а-лизин, аа-apaбиноза, D-галактоза, D-глюкоза, D-рибоза, D-ксилоза, мезо-эритритол. Суб­страты готовят в виде 10%-ных (вес/объем) растворов в буфере Соренсена (рН 7,0), стерилизуют фильтрацией, хранят при -20° С. Da-цитруллин стери­лизуют при 121°С 15 минут. QО₂N объем вычисляют по методу Варбурга с коррекцией на эндогенное поглощение О₂.

Определение способности к росту на питательных средах с фуксином и тионином.Используют Альбими-агар или триптозный агар с красителями в кон­центрации 1:50 000 или 1:25 000. Красители в виде 0,1%-ных растворов ки­пятят в водяной бане в течение 20 минут и затем добавляют в необходимом количестве к расплавленному стерильному агару. Засеянные культурами Чашки Петри инкубируют при 37° С в атмосфере 5-10% СО₂ в течение 4 дней. В качестве контроля на среды высевают эталонные штаммы бруцелл определенных видов. Среды хранят в холодильнике не более 10-15дней. Обесцвеченные среды использовать нельзя.

Испытание культур бруцелл в РА с моноспецифическими сыворотками (М, A, R).Моноспецифические сыворотки получают раздельной иммунизацией кроликов соответствующими эталонными штаммами бруцелл с последующей перекрестной адсорбцией агглютининов этими же штаммами.

Густую суспензию испытуемой культуры бруцелл (~ 2 млрд. мк./мл.), выращенной в течение 48 часов на сывороточно-декстрозном агаре, про­гревают при 60° С в течение часа в 0,5%-ном феноло-солевом растворе,

смешивают каплю суспензии и каплю моноспецифической сыворотки. Ре­зультат учитывают через минуту. Эти исследования необходимо проводить с параллельным контролем в виде антигенов из эталонных штаммов В. abortus (1-й биотип), В. melitensis (1-й биотип), В. ovis и B.canis.

В определенных ситуациях возникает необходимость дифференциации

вакцинного штамма В. abortus N19 от эпизоотических штаммов этого вида бруцелл. В дополнение для этой цели предлагается исследование способности к росту на агаре, содержа­щем тионин (2 мг/мл), на агаре с эритритолом (1 мг/мл) и устойчивость к пенициллину при использовании дисков с пенициллином (5 ЕД). Культуры вакцинного штамма
В. abortus N19 не растут на средах с указанными концентрациями тионина и эритритола и чувствительны к пенициллину, в от­личие от эпизоотических штаммов.

Используют для обнаружения возбудителя в исследуемом материале и про­верки патогенных свойств выделенной культуры. Биопроба является достаточно чувствительным методом выделения бру­целл из материала, особенно если предполагается его контаминация посто­ронней микрофлорой, что достаточно вероятно при исследовании гениталь-ных выделений, молока, сыра и т.д.

Наиболее восприимчивы к бруцеллезу морские свинки и белые мыши, но первые удобнее, так как у них легче брать кровь для серологических исследований. Морских свинок живой массой 350-400 граммов предва­рительно исследуют в РА в разведении сыворотки крови 1:5-1:40. Для опыта берут животных, не имеющих бруцеллезных антител. Заражение про­водят подкожно со стороны внутренней поверхности бедра. Заражают двух морских свинок. Тканевый материал измельчают в стерильном физиологи­ческом растворе 1:10, удаляют грубые частицы путем центрифугирования (1000 об/мин, 5-7 минут), морской свинке вводят 1 мл над осадочной жид­кости. Молоко (20 мл) центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин и вводят весь осадок и сливки двум морским свинкам. Содержимое бурс, абсцессов вводят в дозе 1 мл.

У морских свинок исследуют кровь в РА через 15, 25 и 40 дней после заражения в разведениях 1:10-1:80. Положительная РА в разведении 1:10 и более свидетельствует о заражении. Положительно реагирующих живот­ных убивают, регистрируют патологоанатомические изменения в печени, селезенке, лимфатических узлах, исследуют бактериологическими методами.