Бактериологическое исследование

Лабораторная диагностика ботулизма

Таблица 59 - Ферментативные свойства С. histolyticum и С. sordellii

 

 

 

 

Вид Клостридий				Ферментативные свойства
Лецитиназа	Липаза	Желатиназа	Казеиназа	Индол	Образование кислоты
Глюкоза	Лактоза	Сахароза	Мальтоза
C.sordellii	+	-	+	+	+	+		-	+
C.histolyticum		-	+	+	-	-	-	-	-

Биопроба.Проводят для обнаружения возбудителей непосредствешта в исследуемом мате­риале, а также для определения патогенных свойств изолированных культур.

В первом случае в стерильной ступке растирают кусочки исследуемого мате­риала с небольшим количеством МПБ и 0,5-1,0 см³ материала вводят подкож­но морским свинкам в область брюшных мышц. За животными наблюдают в течение 8 суток. В положительном случае животные погибают через 1-2 суток. Погибших морских свинок вскрывают, учитывают характер паталогоанатомических изменений и проводят бактериологическое исследование. Характер паталогоанатомических изменений у морских свинок, зараженных С. novyi, опи­сан ранее. При наличии в материале С. perfringens типов А и D кожа на месте инъекции легко отслаивается от мышц, которые имеют серовато-грязный цвет, кишечник вздут, сосуды кровенаполнены. В случае заражения С. perfringens типов В и С кожа легко отделяется, но мышцы красного цвета, сухие. Кишечник геморрагически воспален, вздут. Заражение C. sordellii приводит к образова­нию на месте инъекции студенистого отека, мышцы бледные. C. histolyticum при заражении редко вызывает гибель животных. Эффективно внутримышечное за­ражение. В этом случае кожа на месте инъекции красно-фиолетовая, мышцы расплавляются (кашицеобразная масса), газа нет.

 

Ботулизм — остропротекающая кормовая токсикоинфекция. Характеризу­ется поражением центральной нервной системы и сопровождается парезами двигательных мышц. Возбудитель — Clostridium botulinum, продуцирует не­сколько типов токсинов. К токсинам отдельных типов наиболее чувстви­тельны: А — человек, куры; В — человек, КРС, куры; Са — водоплавающая птица; Сb — КРС, лошади, собаки; D — КРС, овцы, реже — лошади, чело­век; Е — человек; F — человек;
G (C.argentinense) — человек.

Лаборатор­ная диагностика ботулизма основана на обнаружении и идентификации ботулинического токсина в крови больных, недавно погибших животных, кор­мах (пищевых продуктах), а также выделении культуры С. botulinum и выяв­лении ее токсигенных свойств.

Объектом исследования являются пробы подозрительных кормов, содержи­мое желудка, кусочки печени, серозный экссудат. От больных животных берут пробы крови. Материал берут не позднее двух часов после гибели животного.

Обнаружение ботулинического токсина.Кровь (сыворотку крови), серозный экссудат, из-за быстрого разрушения токсина, необходимо исследовать в кратчайшие сроки. Перечисленные ма­териалы вводят белым мышам внутривенно (0,3 мл). Наблюдение за жи­вотными ведут в течение пяти суток. В положительных случаях у животных развиваются общая и мышечная слабость, параличи задних конечностей.

Пробы корма, содержимое желудка, кусочки печени массой 25-30 г растирают в ступке со стерильным песком, заливают равным объемом сте­рильного физиологического раствора, выдерживают два часа при комнат­ной температуре. Затем 2/3 материала фильтруют через вату или центрифу­гируют при 3000 об/мин 30 минут. Половину фильтрата прогревают в водя­ной бане при 100° С в течение 20-30 минут. Ботулинический токсин разру­шается при 100° С за 20 минут. Гретый и негретый фильтрат вводят внутри­венно двум белым мышам массой 16-18 г (0,5-0,8 мл), морским свинкам массой 350 г — подкожно (3-5 мл). Наблюдение ведут в течение пяти су­ток. В положительных случаях отмечают наличие шаткой походки, рас­слабление скелетной мускулатуры, западение брюшной стенки (осиная та­лия) и гибель на 2-5-е сутки животных, которым ввели негретый фильтрат, и отсутствие клинических симптомов у животных с гретым материалом («Ме­тодические указания по лабораторной диагностике ботулизма»).

Обнаружение токсина может быть проведено несколько иным способом. Приготовленную взвесь центрифугируют, фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Поскольку токсин может присутство­вать в форме протоксина (Е), то для его активации девять частей фильтра­та смешивают с одной частью 1%-ного раствора трипсина, выдерживают 45 минут при 37° С и затем вводят животным.

На следующем этапе проводят идентификацию токсина в реакции ней­трализации с антитоксическими сыворотками типов А, В, С, D, Е. С этой целью смешивают по 0,2 мл сыворотки каждого типа в одной пробирке, добавляют 1 мл фильтрата, инкубируют 45 минут при комнатной темпе­ратуре или 30 минут при 35-37° С. Далее вводят двум белым мышам массой 16-18 г внутрибрюшинно по 0,8 мл смеси. Двум контрольным животным инъецируют исследуемый фильтрат, разведенный 1:1 стериль­ным физиологическим раствором. Учет результатов проводят, как описа­но выше. При нейтрализации токсина смесью антисывороток и гибели контрольных животных токсин идентифицируют как ботулинический.

В случае необходимости определяют в РН тип ботулинического токси­на по следующей схеме. Фильтрат разливают в шесть пробирок по
2,4 мл. В пять пробирок вносят по 0,6 мл тех или иных типовых антисывороток (А, В, С, D, Е), в шестую — 0,6 мл физиологического раствора. Смеси инкубиру­ют, как описано выше, и вводят каждую внутрибрюшинно двум белым мышам в дозе 0,8-1 мл. Результат учитывают в течение четырех суток. В настоящее время выпускается диагностический набор для иммуноферментного выявления ботулинического токсина (фирма Elcatech).

Обнаружение ботулинического токсина в исследуемом материале счи­тается достаточным основанием для постановки диагноза. При исследова­ниях по выявлению токсина в животном материале необходимо учитывать, что споры C. botulinum могут присутствовать в кишечном тракте здоровых животных, после их смерти способны размножаться в кишечнике в ана­эробных условиях и продуцировать токсин.