Выделение и идентификация культур микобактерий

Молекулярные методы

Фирма «Нарвак» выпускает тест-систему для идентификации и диффе­ренциации М. bovis и М. tuberculosis в ПЦР.

Культивирование.Бактериологическое исследование позволяет выявить 20-100 микобак­терий в 1 г исследуемого материала, т.е. он существенно чувствительнее бактериоскопического.

Из каждого лимфатического узла вырезают кусочки объемом около 0,5 см³ на границе здоровой и измененной ткани. Общая масса ткани лим­фатических узлов должна быть 6-10 г. Лимфатические узлы из области илеоцекального соединения и подвздошной кишки обрабатывают и высе­вают отдельно.

Исследуемый материал перед посевом на питательные среды подвер­гают обработке с целью подавления роста сопутствующей некислоустойчивой микрофлоры, освобождения микобактерий от муцина (в образцах трахеобронхеальной слизи), концентрирования клеток возбудителя. Для достижения перечисленных целей применяют методы, указанные ранее, а также нижеследующие.

Обработка материала щелочью.Более удобна, так как нет очень жест­ких ограничений времени контакта щелочи с материалом, кроме того, ще­лочь растворяет муцин, гной и т.д. В колбу с бусами помещают исследуе­мый материал и 4-6%-ный раствор NaOH в соотношении 1:2 и содержи­мое периодически встряхивают в течении 15-20 минут. Далее щелочь ней­трализуют 50%-ной H₂S0₄, содержащей настойку лакмуса. Кислоту вносят по каплям до момента розово-фиолетового окрашивания жидкости. После нейтрализации взвесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 9-10 минут. Осадок высевают на плотные яичные среды.

 

Обработка материала трехзамещенным фосфатом натрия.Данная соль угнетает рост некислотоустойчивой микрофлоры и почти не влияет на микобактерии. Исследуемый материал и 10%-ный раствор трехзамещенного фос­фата натрия смешивают в соотношении 1:1, выдерживают в термостате при 37° С в течение 24 часов, нейтрализуют соляной кислотой, центрифугируют и высевают на питательные среды.

 

Материал, содержащий муцин.Материал смешивают с равным объе­мом раствора, содержащего тринатрий фосфат и цефиран (В 1000 мл горячей воды растворяют 250 г Na₂HP0₄*12H₇0 и добавляют 1,85 мл цефирана (17%-ный), встряхивают в течение 30 минут, центрифугируют и осадок ресуспендируют в 20 мл бу­ферного раствора (37,5 мл 0,067 N двунатрия фосфата и 62,5 мл 0,067 N калия фосфата (конечный рН 6,6), нейтрализующего цефиран и вновь центрифугируют 20 минут. Осадок высевают на питательные среды.

Плотные образцы материала (лимфатические узлы).Материал (неизмельченные образцы) выдерживают 4-16 часов в растворе гипохлорита (1:1000). Затем ткани и жировую пленку переносят в ступку со стерильным бульоном и индикатором фенолротом, измельчают, добавляют 2-4%-ный NaOH на 20-30 минут. Далее суспензию нейтрализуют 2N НС1, центри­фугируют с целью концентрации микобактерий, осадок высевают на пита­тельные среды, готовят окрашенные препараты для микроскопии.

Согласно ГОСТ 26072-89 рекомендуется материал обрабатывать по Го­ну или Аликаевой.

Для культивирования микобактерий используют различные питатель­ные среды. Наиболее подходят для первичной изоляции среды Левенштейна-Иенсена, Гельберга, Петраньяни, а также среда Stonebrinks для Mycobacterium bovis. Селективные свойства средам придает добавка малахитового зеленого (0,025 г/100 мл).

Для своего роста требуют добавления глицерина (4-5%) М. tuberculosis, М. avium и ряд атипичных микобактерий, однако при этом необходимо учи­тывать, что глицерин ингибирует натрий пируват (0,4%), стимулирующий рост М. bovis.

Селективные свойства сред можно повысить добавлением линкомицина (2 мкг/мл), циклогексимида (400 мкг/мл). М. bovis при выделении из материа­ла проявляет микроаэрофильные свойства, не требует глицерина, темпера­турный оптимум 38-40° С, М. avium —температурный оптимум 38-41° С, рН 6,8-7,3. М. tuberculosis — в первичных посевах рост стимулируется на­личием в атмосфере 10-15% СО₂, температурный оптимум 37-38° С, рН 6,4-7,0.

Подготовленый тем или иным способом материал засевают в 5-10 про­бирок с плотными средами. Посевы инкубируют при 37-38° С в наклон­ном положении. Через 48 часов посевы просматривают, если цвет среды не восстановился, посев повторяют. Пробирки с ростом посторонней микро­флоры выбраковывают, в остальных пробки парафинируют. В последую­щем посевы просматривают еженедельно до 3 месяцев.

 

Ускоренные методы культивирования микобактерий (метод микрокуль­тур на стеклах).На двух предметных стеклах готовят мазки из посевного материала. Мазки подсушивают в термостате, обрабатывают 5-10 минут 6%-ным раствором серной кислоты и трижды промывают дистиллирован­ной водой. Затем оба стекла складывают вместе (обратными поверхностя­ми) и помещают в культуральный сосуд, содержащий свежую гемолизированную кровь в разведении 1:4-1:6, инкубируют в течение недели. Один из мазков вынимают, промывают и окрашивают по Циль-Нильсену или люминесцирующими красителями.

Вирулентные штаммы образуют на стеклах микроколонии в виде кос, жгутов (наличие корд-фак­тора) или звездчатых образований.

Сапрофитные и атипичные микобакте­рий обычно грубее, толще, не образуют сплетений. Метод уступает по чувствительности обычному посеву на питатель­ные среды и может быть использован лишь как вспомогательный.

При обнаружении роста микобактерий для изучения свойств выделен­ной культуры отбирают колонии, наиболее характерные для возбудителей туберкулеза, бактериальную массу тщательно растирают в 1-1,5 мл сте­рильного физиологического раствора. Взвесь засевают на яичные среды и пробирку с МПБ.

Особенности роста микобактерий на питательных средах.По скорости роста на питательных средах различают медленнорасту­щие микобактерий туберкулезного комплекса (М. tuberculosis, M. bovis), микобактерий 1,2,3 групп по классификации Ранион, а также быстрорас­тущие микобактерий. Деление микобактерий на медленно- и быстрорасту­щие достаточно условно. К медленнорастущим принято относить виды, дающие макроскопически видимый рост на питательных средах позднее семи суток культивирования. Кроме классических возбудителей туберкулеза описано много микобактерий, отличающихся главным образом тем, что они не вызывают характерного для туберкулеза заболевания при подкожном заражении морских свинок. Эти микобактерий объединены под общим на­званием «атипичные микобактерий». Патогенные свойства некоторых из них представлены в таблице 41.

Ранион по скорости роста и пигментообразованию под­разделил атипичные микобактерий на следующие группы:

Фотохромогенные— колонии формируются через 2 недели при 37° С ичерез 3 недели — при комнатной температуре. Образуют желто-оранжевый пигмент, при культивировании на свету дают более интенсивное окрашива­ние колоний. Типовой вид — M. kansasii. Пигмент образован кристаллами В-каротина, которые различимы при изучении колоний под малым увеличе­нием, что позволяет достаточно надежно отличить бактерии этой группы от других микобактерий. M. kansasii образует колонии от SR до RS, но могут быть и R-формы. M. marinum — S/SR,
M. simiae — S.

Скотохромогенные.У пигментнообразующих штаммов колонии окра­шены в желто-оранжевый цвет независимо от культивирования на свету или в темноте. M. scrofulaceum образует колонии S-формы через две недели культивирования.

Нефотохромогениые бактерии.Колонии формируются через 5-10 су­ток или позднее. Колонии обычно кремовые, иногда полупрозрачные, S-формы, реже SR- и R-формы. Старые культуры некоторых штаммов мо­гут быть желто-оранжевыми, но окрашивание не зависит от наличия света.

Весьма сходны виды М. avium и M. intracellulare (комплекс avium-intracellulare). Образуют звездчатые микроколонии. М. avium растет при 42-45° С. M. intracellulare не дает роста в течение трех недель инкубиро­вания.

Умеренно, и быстрорастущие микобактерии.Колонии формируются в течение 7 суток при 37 и 25° С. Адаптированные культуры могут давать макроскопически видимые колонии через 1-2 суток, рост первичных куль­тур может быть замедленным (до двух недель). Дифференцировать от дру­гих микобактерий по признаку пигментообразования согласно Ранион их не удается, так как на это сходство оказывают влияние многие факторы. При дифференциации принимают во внимание способность к росту при тем­пературе более 45° С и ускорение роста при оптимальной температуре.

При учете результатов посева исследуемого материала на питательные среды пробирки, в которых рост микобактерий появился в течение первой недели инкубирования, из дальнейшей работы исключают как содержащие сапрофитные быстрорастущие микобактерий.

Для основных патогенных видов микобактериий характерен следую­щий тип роста на питательных средах.

M. tuberculosis.В первичных посевах макроскопически видимый рост наблюдается обычно на 20-30 сутки. В жидких питательных средах рост характеризуется появлением на поверхности сухой, складчатой пленки, под­нимающейся по стенкам сосуда, среда остается прозрачной — эугонический рост. В средах с твином-80 с потерей гидрофобности наблюдается диф­фузный рост. На плотных средах характерен интенсивный рост в виде узелковоподобного, морщинистого, сухого налета цвета слоновой кости. Ко­лонии R-формы, морщинистые, суховатые, имеют неровный край, центр обычно приподнят (вирулентные штаммы). Могут встречаться S-варианты культуры.

M. bovis.Первичный рост на плотных средах наблюдается на 20-60 сутки (субкультуры на 20-30 сутки). В жидких питательных средах проис­ходит рост на поверхности среды в виде единичных островков, постепенно сливающихся в пленку — дисгонический рост. На плотных средах растет в виде мелкоморщинистого, сухого, сероватого налета. Колонии мелкие, сухие, блестящие, полушаровидные, гладкие, с неровными краями, цвета слоновой кости, иногда встречаются складчатые колонии.