Выделение и идентификация возбудителя сибирской язвы

Молекулярные методы

Фирма «Нарвак» выпускает тест-систему для идентификации возбуди­теля, имеющего ген капсулообразования (сарВ), в ПЦР. Чувствительность метода 1x10³ - 2x10³ мк/г ткани.

В. anthracis — факультативный анаэроб, температурный оптимум 35- 36° С, оптимум рН 7,4. К питательным средам неприхотлив. Исследуемый штериал высевают на МПБ, МПА или бульон и агар Хоттингера, для выяв­ления способности к капсулообразованию на среду ГКИ, Томова, Буза. На средах Томова, Буза посевы инкубируют в атмосфере 20-40% СО₂. Одновреенно можно делать посев из свежего материала (с минимальным количеством крови) в систему для диск-прицепитации. Контаминированный материал засевают на дифференциально-диагностические среды с фенолфталеинфосфатом натрия, среду Kinsley. Посевы инкубируют при 36° С18-24 часа и учитывают результат. При отсутствии роста посевы выдерживают еще 48 часов.

Характер роста В. anthracis на питательных средах. На обычных плотных питательных средах возбудитель формирует крупные шероховатые серо-белые колонии диаметром 2-3 см (R-формы). Центр нли может быть затемнен, периферия с локонообразными отростками, ожно наличие колоний без отростков и слабо выраженной шероховатостью. Характерную структуру колонии изучают под малым увеличением микроскопа: колония состоит из локонов («голова Медузы», «львиная гри­ва»), которые в свою очередь образованы переплетающимися цепочками бактерий. Кроме колоний R-формы могут появляться колонии S- и проме­жуточной О-формы, редко колонии с незначительной узорчатостью — эро­зивная форма.

При росте В anthracis в МПБ среда остается прозрачной, на дне осадок в виде ватообразных хлопьев (типичный рост), иногда возможен диффузный рост.

На дифференциально-диагностической среде отбирают для изучения ко­лонии бактерий с отрицательной реакцией на щелочную фосфатазу. Для это­го в крышку чашки Петри с посевами наливают 1-2 мл 25%-ного водного раствора аммиака. Закрытую чашку (крышкой вниз) выдерживают 1 мину­ту при комнатной температуре, затем просматривают под малым увеличени­ем микроскопа. Отбирают для изучения все бесцветные колонии (нет щелоч­ной фосфатазы) и не исследуют порозовевшие колонии.

На средах Томова и Буза колонии S или SM-формы гладкие, блестящие, слизистой консистенции. Среда Томова обладает селективными свойства­ми, на ней растет В. cereus, но не растут В. subtilis, В. megaterium.

Рост В. anthracis в системе для диск-преципитации сопровождается че­рез 16-20 часов образованием в средней части столбика агарового геля тонкой белой линии преципитации (диск). Антигенно-родственные виды бацилл (В. cereus) могут образовывать в нижней части агарового столбика (на границе с иммунной сывороткой) более толстую, рыхлую зону преципи­тации. Для изучения отвивают культуры, давшие при росте зону преципи­тации.

Морфология и тинкториальные свойства В. anthracis в культуре. Из подозрительных колоний, бульонных культур, систем для диск-пре­ципитации (при наличии преципитации) делают мазки и окрашивают по Граму люминесцирующими сыворотками.

В бульонной культуре и колониях клетки возбудителя образуют более длинные цепочки, чем в животных тканях. Палочки при этом слегка утол­щены на концах («бамбуковая трость»). Возбудитель на обычных питатель­ных средах капсулу не формирует, но она есть у клеток культур, выращен­ных на средах Томова и Буза. В мазках из бульонной культуры с диффуз­ным ростом в основном находят отдельно или парно расположенные клет­ки, редко — короткие цепочки. Ре­зультаты люминесцентной микроскопии имеют ориентировочное значение.

При обнаружении в окрашенных препаратах бактерий с характерными для В. anthracis морфологическими и тинкториальными свойствами куль­туры отвивают на МПА, МПБ, можно на систему для диск-преципитации с целью дальнейшего изучения. Смешанные культуры дробно рассевают на МПА в чашках Петри или заражают белых мышей для получения чистой культуры возбудителя.

В. anthracis образует споры в питательных средах, бедных белковым азотом, углеводами; быстрее на плотных, чем жидких средах. При 37° С уже через 30-40 часов отмечается интенсивное спорообразование, при 18-20° С — через 48-72 часа. Споры овальной формы, сильно преломляют свет, размеры 0,8-1,0х1-1,5 мкм.

Биопроба. Проводят одновременно с посевом материала на питательные среды. Ис­следуемый материал суспендируют в небольшом объеме стерильного физиологического раствора, 0,2-0,5 мл взвеси вводят двум белым мышам под­кожно в область спины или 0,5-1,0 мл двум морским свинкам подкожно в область живота. Наблюдение за животными ведут в течение 10 суток, ги­бель в положительных случаях обычно наступает через 1-3 суток. Пав­ших животных подвергают полному бактериологическому исследованию.

Гибель хотя бы одного из двух зараженных лабораторных животных и выделение культуры возбудителя из его органов является основанием для постановки положительного диагноза.

Если чистая культура возбудителя получена ранее гибели животных, зараженных исследуемым материалом, то, не дожидаясь результатов био­пробы, проверяют патогенность выделенной бактерии путем заражения двух белых мышей суточной бульонной культурой.

При исследовании материала от свиней, с учетом штаммовых вариаций по вирулентности, необходимо заразить до 10 мышей, а наблюдение про­должать за зараженными животными до 10-20 дней.

У штаммов В. anthracis вирулентность может варьировать в широких пределах. Для оценки свойств штаммов представляют интерес критерии по определению типа В.anthracis, предложенные Dong Shulin (цит. по Бакулову И.А. и соавт., 2001). Те или иные свойства штамма связаны с присут­ствием в клетках плазмид, детерминирующих синтез факторов вирулентно­сти. С точки зрения диагностики существенны следующие фенотипические признаки В.anthracis, обусловливаемые плазмидами: наличие капсулы, токсина, патогенность для животных и форма колоний. С целью установле­ния типа штамма испытуемую культуру засевают на плотную и жидкую питательные среды с 50% сыворотки крови барана или кролика и 0,9% NaHCО₃. Посевы инкубируют при 37° С в атмосфере 10-12% С0₂ в тече­ние 24 часов. На плотных средах, в зависимости от характеристик штам­ма, могут формироваться колонии R-, S- и М-формы, клетки бактерий мо­гут быть капсулированы или нет, в культуральной жидкости может присут­ствовать или отсутствовать экзотоксин, культуры могут быть патогенны­ми или непатогенными для животных. Согласно Dong Shulin штаммы по этим критериям подразделяются на четыре типа.

1-й тип. Вирулентный штамм. Колонии М-формы, есть капсула, токсин (культуральный фильтрат при внутрикожном введении кроликам или морс­ким свинкам вызывает образование отека) выявляется в РДП, культура патогенна для животных. Такие свойства обусловлены наличием плазмид рх01и рх02.

2-й тип. Вакцинный штамм. Колонии R-формы, капсулы нет, токсин есть, культура не патогенна для животных. Имеется плазмида рх01.

3-й тип. Авирулентный штамм. Колонии М-формы, есть капсула, токси­на нет, культура патогенна для животных. Присутствует плазмида рх02.

4-й тип. Непатогенный штамм. Колонии S-формы, капсулы и токсина нет, культура не патогенна для животных. Плазмиды отсутствуют.

Дифференциация возбудителя сибирской язвы от сапрофитных бацилл. В том случае, когда в мазках из исследуемого материала обнаруживают капсулированные бактерии с типичными для В. anthracis морфологически­ми и тинкториальными свойствами, а при посеве на питательные среды вы­деляют характерные по культуральным и морфологическим свойствам бак­терии, то дальнейшее изучение культуры не проводят и диагноз считают установленным.

При отсутствии четких результатов микроскопического исследования исходного материала и характерных для возбудителя культуральных при­знаков, не дожидаясь результатов биопробы, исследуют чувствительность выделенной культуры к пенициллину (тест «жемчужного ожерелья») и си­биреязвенному фагу.

При необходимости дифференциации выделенной культуры от сапрофит­ных бацилл также дополнительно определяют у нее способность к капсулообразованию в опытах in vitro, in vivo, рост в аэробных, анаэробных условиях, наличие жгутиков, гемолитическую активность, синтез лецитиназы, уреазы, реакцию Фогес-Проскауера, образование кислоты из арабинозы, ксило­зы, гидролиз желатина, крахмала. Самыми надежными методами идентифика­ции В. anthracis считаются тест на фагочувствительность, обнаружение в ПЦР-генов, кодирующих синтез токсина и капсулы, наличие патогенных свойств.

Некоторые из перечисленных методов исследования изложены ниже.

 

Определение вирулентности культур В. anthracis на кроликах. Используют кроликов массой 2-2,5 кг. Исследуемый штамм выращи­вают на МПБ (24 часа), затем засевают на МПА, агар Хоттингера, культи­вируют 3-4 дня при 37° С. Путем микроскопии окрашенных мазков конт­ролируют уровень спорообразования.

Когда он достигает 90-100%, бактериальную массу смывают физиоло­гическим раствором и по стандарту мутности готовят взвеси с содержанием 1 млн, 100 тыс. и 1000тыс. спор в 1 мл. Каждой взвесью в объеме 1 мл заражают подкожно в область живота двух кроликов, наблюдение ведут в течение 10 суток.

Слабо вирулентные и авирулентные штаммы не вызывают гибели кроликов при любой дозе; умеренно вирулентные штаммы вызывают гибель животных при дозах 1 млн. - 100 тыс. спор; высоко вирулент­ные штаммы обусловливают гибель при дозе 10 тыс. спор.

Метод применяют для изучения штаммов, выделенных из объектов внеш­ней среды.

 

Метод обнаружения капсулообразования in vivo. Бульонную культуру в дозе 0,1-0,2 мл вводят внутрибрюшинно 6-8 белым мышам. Животных убивают через 1,2 и 3 часа, вскрывают, из перитонеального экссудата и органов делают мазки, окрашивают одним из ме­тодов на капсулу и микроскопируют.

 

Метод обнаружения капсулообразования in vitro. Испытуемую культуру высевают на среду ГКИ, Шляхова, пробирки закрывают резиновыми пробками, культивируют при 37^СС. Через 0,5-2 часа у части, а через 15-18 часов у большинства клеток обнаруживают капсулу.

Испытуемую культуру также можно высевать на плотные среды Томова, Буза. Инкубирование проводят в атмосфере 20-40% СО₂ при 37° С в течение 18-24 часов. При этих условиях на среде Томова возбудитель растет в S-форме и образует капсулу. На среде Буза возбудитель образует гладкие, слизистой консистенции колонии и, в отличие от В. cereus, не дает гемолиза.

 

Определение чувствительности к пенициллину (тест «жемчужного ожерелья»). В чашки Петри разливают обычный МПА и с содержанием 0,5 и 0,05 ЕД пенициллина в 1 см³. Из застывшего агара выреза­ют квадраты геля (1,5х1,5 см), помещают их на предметные стекла в чаш­ках Петри, засевают при помощи бактериологической петли 3-часовой бу­льонной испытуемой культурой и помещают в термостат. Через 1-3 часа на поверхность агаровой пластины помещают покровное стекло и препа­рат изучают в микроскопе с сухой (объектив х 40) и иммерсионной система­ми. Чувствительные к пенициллину клетки В. anthracis принимают форму шара, а цепочки имеют вид «ожерелья», что является следствием
L-трансформации клеток в результате нарушения синтеза клеточной стенки. В кон­троле на обычном агаре клетки В. anthracis имеют обычную форму. При отрицательном результате инкубирование продолжают до 6 часов и проводят окончательный учет результатов. Сапрофитные бациллы не чувстви­тельны к пеницилину и при посеве на указанные среды не меняют морфоло­гию клеток.