Серологическая диагностика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза

Таблица 33 - Свойства и дифференциация Y.pestis и Y.pseudotuberculosis

И Y.enterocoutica, отличающие их от других видов рода Yersinia

Таблица 32 - Основные биохимические свойства Y.pseudotuberculosis

 

Тесты		Y.enterocoUtica	Y. frederi ksenii	Y. inter­media	Y.kris tensenii	Y. aldovae
Y.pseudotuberculo­sis	Биовары
	I	I I	III	IV	V
Лактоза 37° С	-	+	-	-	-	-	d	d	-	-
Мальтоза 37° С	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-
Сахароза 37° С	-	+	+	+	+	d	+	+	-	-
Фогес-Проскауер 37° С	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Фогес-Проскауер 25° С	-	+	+	+	+	+	+	+	-	+
Рамноза 25° С	+	-	-	-	-	-	+	+	-	+
Цитрат Сим­монса 37° С	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Цитрат Сим­монса 25° С	-	-	-	-	-	-	d	-	-	d
Индол	-	+	+	-	-	-	+	+	d	-
Ксилоза 37° С	+	+	+	+	-	-	+	+	d	d
Салицин 37° С	d	+	-	-	-	-	+	+	d	-
Сорбит 37° С	-	+	+	+	+	-	+	+	+	+
Трегалоза 37° С	+	+	+	+	+	-	+	+	+	-

Обозначения:«+»— признак положительный; «-» — признак отрицательный;
«d» — признак варьирует у различных штаммов.

 

Возбудитель псевдотуберкулеза по ряду свойств сходен свозбудите­лем чумы (Y. pestis) и в ряде случаев, главным образом при исследовании материала от грызунов (особенно в природных очагах чумы), когда посе­вы из органов производят непосредственно на плотные питательные среды, может возникнуть необходимость дифференциации этих возбудите­лей. Основные отличительные признаки Y. pseudotuberculosis и Y. pestis представлены в таблице 33.

 

 

Тест или свойство	Реакция
	Y. pestis	Y. pscudotubcrculosis
Подвижность при 37° С	-	-
Подвижность при 25° С	-	+
Гидролиз мочевины	-	+
Ферментация адонита	-	+
Ферментация L-рамнозы	-	+
Ферментация мслибиозы	-	+
Чувствительность к фагу при 37° С	+	d
Чувствительность к фагу при 25° С	+	-
Реакция с антисывороткой к фракции 1 Y.pestis	+	-
Продукция коагулазы	+	-
Продукция фибринолизина	+	-
Патогснность для мышей	+	+
Патогснность для белых крыс	+	-
Патогснность для морских свинок	+	+
Патогснность для кроликов	-	-

Наиболее ценными для дифференциации этих возбудителей являются тесты, характеризующие их отношение к мочевине, подвижность, наличие фибринолизина и плазмокоагулазы. Кроме того, следует учитывать непри­хотливость к питательным средам Y.pseudotuberculosis и отсутствие поли­морфизма у колоний Y.pestis, который обычно растет на специальных сре­дах, и при 28° С на вторые сутки образует колонии только
R-формы. При подозрении на выделение Y.pestis дальнейшую идентификацию проводят в специализированных учреждениях.

Культуры, отнесенные к видам Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis, подвергают серологической идентификации в реакции агглютинации на стекле. Завершающим этапом является определение патогенных свойств выделенных штаммов иерсиний.

 

Серологическая индикация и идентификация иерсиний. Y.enterocolitica имеют соматический (О) и жгутиковый (Н) антигены.
У вирулентных штаммов обнаруживаются V- и W-антигены, расположенные в наружной мембране клетки. У отдельных штаммов имеется антиген К1, связанный с фимбриями и разрушающийся только автоклавированием при 120° С в течение час.

О-антигены возбудителя кишечного иерсиниоза являются полисахари­дами, устойчивыми к нагреванию и действию этанола. Согласно классифи­кации Winbland—Wauters по О-антигену различают более 60 сероваров Y.enterocolitica, которые обозначают арабскими цифрами 1,2 и т.д. Часть сероваров имеет разделение на субсеровары, обозначаемые буквами a, b и т.д. Также буквами обозначают и жгутиковый термолабильный антиген, разрушающийся при кипячении.

Наиболее распространенными среди животных и людей являются серова­ры: 0l,2a,3; 02a, 2b,3; 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 06,31; 07,8; 08; 09; 010; 013,7; 014; 015; 018; 019, 8; 020; 021 и 022.

Y.enterocolitica серовара О3 распространены на всех континентах. Ча­стота их обнаружения на территории России составляет от 15 до 60% и более. Далее следуют серовары 04,32 и 05,27 (10-50%), 07,8 (5-10%) и 09 (1-30%). Другие из названных сероваров встречаются значительно реже. Часть культур типировать не удается.

Y.pseudotuberculosis имеют жгутиковый антиген (Н), 2 соматических (О) антигена S и R, антигены вирулентности — V и W, расположенные в наруж­ной мембране и выраженные при температуре культивирования иерсиний 37° С. Н-антиген образуется при температуре 18-20° С, термолабилен и не имеет диагностического значения. R-антиген является общим для всех псев­дотуберкулезных бактерий, а также и для Y.pestis. Обнаружена общность этого антигена с сальмонеллами групп В и D. По
S-антигену различают 8 сероваров Y.pseudotuberculosis, обозначаемых римскими цифрами (I-VIII). Большая часть штаммов, выделенных на территории России, как и в дру­гих странах, от животных, человека, из объектов внешней среды, относит­ся к серовару I (60-90%). На втором месте по частоте обнаружения нахо­дится серовар III (10-30%). Серовары II, IV, V обнаруживают в 2-8% случаев. О циркуляции в нашей стране Y.pseudotuberculosis сероваров VI, VII и VIIIсведений нет.

Антигенные связи Y.pseudotuberculosis и большинства сероваров
Y. enterocolitica слабые и выявляются лишь иммунно-диффузионными мето­дами. Более значительные антигенные взаимодействия, проявляющиеся в традиционной РА, имеют место у возбудителя псевдотуберкулеза серовара I с культурами Y.enterocolitica сероваров 08; 018 и 021.

Оба возбудителя имеют общий антиген с энтеробактериями других видов, за счет чего могут быть получены положительные реакции с сы­воротками к некоторым представителям этого семейства. У Y.pseudotuberculosis установлены антигенные связи с сальмонеллами шигеллами и эшерихиями, у Y.enterocolitica — с сальмонеллами, проте­ями, серрациями, гафниями, клебсиеллами. Особо следует отметить на­личие антигенного родства у серовара 09 с представителями рода Brucella.

В связи с этим в благополучных по бруцеллезу хозяйствах не­редко выявляются неспецифические реакции с бруцеллезным диагностикумом, обусловленные инфицированием крупного рогатого скота Y.enterocolitica. Возбудитель кишечного иерсиниоза имеет антигенное родство с холерным вибрионом и возбудите­лем туляремии. С Y.pestis близкие антигенные связи и постоянные перекрестные положи­тельные результаты реакций имеет возбудитель псевдотуберкулеза. Y.enterocolitica не имеет антигенных связей с Y.pestis.

Серологической идентификации подлежат культуры, отнесенные по био­химическим свойствам к видам Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica. Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с диагностическими сыворотками к наиболее распространенным сероварам иерсиний. Наборы, выпускаемые для этих целей (Санкт-Петербургский институт им. Пастера), включают сыворотку, поливалентную к I-V сероварам, и сыворотки, моновалентные к I и III сероварам Y.pseudotuberculosis, а также сыворотки к сероварам: 03; 04,32; 04,33; 05,27; 05; 06,30; 07,8; 08; 09 и 013,7 Y.enterocolitica.

Реакция агглютинации ставится по общепринятой методике. С этой целью из флакона пастеровской пипеткой набирают сыворотку, не захва­тывая при этом осадка со дна флакона. Каплю сыворотки наносят на пред­метное стекло и тщательно растирают в ней петлю 20-24-часовой агаро­вой культуры испытуемого штамма. После получения гомогенной суспен­зии стекло покачивают осторожными круговыми движениями. Положи­тельная реакция (агглютинация) наступает сразу или не позднее 2-
3 мин в виде склеивания бактериальной массы с образованием плотных, с тру­дом разбивающихся зернышек. Жидкость при этом полностью или час­тично просветляется.

При отрицательной реакции смесь сыворотки и бактериальной массы остается в виде равномерной гомогенной взвеси.

В последние годы разработан и успешно апробирован ряд методов ди­агностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, направленных на обнаружение возбудителей или их антигенов в патологическом материале от павших животных, а также в копрофильтратах и моче больных живот­ных с подозрением на псевдотуберкулез и иерсиниоз.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В последнее десятилетие установлена прямая зависимость между степе­нью выраженности вирулентных свойств Y.pseudotuberculosis и концентра­цией антигенов вирулентности в наружней мембране. Показано, что для реализации адгезии возбудителя к эпителию слизистой оболочки кишечни­ка с последующей инвазией и размножением в эпителии и макрофагах необ­ходима экспрессия белков наружной мембраны (БНМ) — антигенов виру­лентности. Данное обстоятельство делает перспективным использование БНМ с диагностическими целями.

В настоящее время разработано и апробировано 3 варианта тест-систем для ИФА, направленного на обнаружение БНМ иерсиний:

ИФА-ЛПС — псевдотуберкулезная система с широким спектром при­менения как для диагностики псевдотуберкулеза, так и для решения эпиде­миологических вопросов. Чувствительность метода —10⁵ микробных кле­ток в 1 см³ пробы, что соответствует 100 мкг/мл липополисахарида возбу­дителя. Эффективность метода 70,2-81,1%;

ИФА-БНМ-1 — тест-система для ранней диагностики псевдотубер­кулеза. Обладает строгой специфичностью и позволяет выявлять воз­будителя в органах и тканях животных, копрофильтратах и моче. Она наиболее эффективна при исследовании материала в начальный пери­од болезни, когда антигены обнаруживают в 69-84% проб копрофиль-тратов и в 21-38% проб мочи. Чувствительность метода 10^s-5х10⁵ микробных клеток в 1 см³;

ИФА-БНМ-П — тест-система для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в материалах от больных (копрофильтраты, моча), павших и вынужденно убитых животных.

Для определения видовой принадлежности выявленных иерсиний (анти­генов возбудителя) пробы, давшие положительную реакцию в тест-системе ИФА-БНМ-П, проверяют в тест-системе ИФА-ЛПС для выявления возбу­дителя (антигенов) псевдотуберкулеза.

Чувствительность метода — 10⁵ микробных клеток в 1 см³, эффектив­ность — до 83,6% положительных проб при исследовании копрофильтратов в первые 5 дней болезни. На пике инфекционного процесса данным методом выявляют до 70% инфицированных животных.

Для исследования материала в тест-системе ИФА-БНМ-П копрофильтраты, выпот брюшной полости вносят в фосфатно-буферную или буферно-казеиново-дрожжевую среду в количестве 1 г на 5 см³ среды для подращи­вания при температуре 3-7° С. Внутренние органы и ткани растирают с этими средами в ступке (соотношение 1:5). Образцы исследуют в первые сутки получения проб и затем на 3-5-е сутки от начала подращивания. Мочу исследуют в нативном виде.

Результаты учитывают визуально или спектрофотометрически. В пер­вом случае реакцию оценивают в крестах по интенсивности появляющего­ся коричневого окрашивания в лунках. Положительной считают реакцию с пробой, которая дала реакцию не менее чем на ++, и по интенсивности окраски существенно отличается от проб отрицательного контроля (К-, оцененные как «-» или «+»). Положительные результаты должны быть и в пробе с положительным контролем (К +).

При спектрофотометрическом учете результатов содержимое лунок с отрицательным контрольным образцом (К-) используют в качестве нуле­вого контроля. Измерение оптической плотности проводят при длине вол­ны 450 нм и считают результат положительным, если коэффициент погло­щения светового потока исследуемого образца достигает величины не ме­нее 0,05.

Наборы компонентов для постановки всех трех вариантов ИФА разра­ботаны Санкт-Петербургским институтом эпидемиологии и микробиоло­гии им. Пастера. Каждый из компонентов рассчитан на проведение 192 анализов, включая контроли.

Реакция коагглютинации (РКА). Для постановки РКА пробы мочи и копрофильтратов (с подращиванием и без него) прогревают в водяной бане в течение 30-40 мин, центрифугиру­ют, фильтруют и исследуют надосадочную жидкость. Сыворотку крови ис­следуют в нативном состоянии.

На предметное стекло, разделенное на необходимое число секторов, наносят капли исследуемого материала. В каждую из капель исследуемого образца добавляют по 1 капле коагглютинирующих диагностикумов раз­личных видов и сероваров иерсиний, в последнюю каплю вносят взвесь несенсибилизированных стафилококков (отрицательный контроль). В ка­честве положительного контроля на отдельном предметном стекле смеши­вают по 1 капле каждого использованного диагностикума с 1 каплей липо-полисахарида соответствующих бактерий в концентрации 10-20 мкг/см³. Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская сли­яния проб, расположенных рядом. Результат реакции учитывают через 5-30 минут экспозиции стекол во влажной камере по образованию хлопьев агглютината стафилококков и просветлению жидкости.

РКА наиболее эффективна в начальный период острого заболевания (1-5-й дни), при других формах — в сроки максимальной выраженности клинических признаков. По данным различных авторов чувствительность данного мето­да исследований составляет 10⁵-10⁸ микробных клеток/см³. Эффек­тивность при кишечном иерсиниозе —до 85%, при псевдотуберку­лезе — до 60-70% в первые 5 дней от начала болезни. В отличие от РА при постановке РКА не наблюдается перекрестных реакций с другими представителями энтеробактерий, бруцеллами. Использо­вание РКА сокращает сроки исследования на иерсиниоз с 14-17 до 3-4 суток в сравнении с традиционным бактериологическим иссле­дованием.

 

Реакция латекс-агглютинации (РИА). РИА используют для выявления антигенов возбудителей псевдотубер­кулеза и кишечного иерсиниоза в копрофильтратах и в смывах с объектов внешней среды. В отличие от РКА, в качестве носителей иммуноглобули­нов используют частицы латекса, которые не обладают антигенностью, а потому предпочтительнее стафилококка. Латексный псевдотуберкулезный диагностикум выпускается Санкт-Петербургским НИИ вакцин и сыворо­ток. Сконструированы латексные диагностикумы и для индикации Y.enterocolitica сероваров О3; О5, 30; О7,8.

Чувствительность метода — 10⁶ микробных клеток в 1 см³ исследуемой пробы. Диагноз на псевдотуберкулез данным методом может быть подтвер­жден у 73% больных животных.

Большинство штаммов Y.enterocolitica, выделяемых на территории Рос­сийской Федерации от животных, человека и из объектов внешней среды, относятся к сероварам О3; О9; О5, 27; О8; О6, 30. В Европе преобладают бактерии сероваров О3 и О9, в США — О8, на Дальнем Востоке — О6.

В многочисленных работах, посвященных изучению иерсиниозов у жи­вотных, сообщается, что практически на всех территориях от свиней изоли­руют Y.enterocolitica сероваров О3; 04,32; 05; 05,27; 06,30; 07; 08; 09; 011;012;017 и 019,а иерсиний, выделенные от крупного рогатого скота, относятся к сероварам О3; 04; 05,27; 07,8; 012; 013 и 018.

 

Определение патогенности Y.pseudotuberculosis являются безусловно патогенными микроорганиз­мами. У них, в отличие от Y.enterocolitica, отсутствует зависимость виру­лентности от наличия плазмиды, контролирующей синтез V- и W-антигенов и кальцийзависимость роста, поскольку бесплазмидные варианты сохраня­ют инвазивные и цитотоксические свойства. Это указывает на определяю­щую роль хромосомного контроля основных патогенных свойств Y.pseudotuberculosis. Поэтому выделение чистой культуры, отнесение ее к виду Y.pseudotuberculosis и определенному его серовару являются доста­точными основаниями для постановки диагноза на псевдотуберкулез. Од­нако и в этом случае иногда прибегают к постановке биопробы. С этой целью ставят кератоконъюнктивальную пробу (тест Шереня) на морских свинках. При этом в один из конъюнктивальных мешков животного инокулируют каплю суспензии испытуемого штамма концентрацией 10¹⁰ микроб­ных тел. При положительном результате в течение 48-72 час развивается гиперемия конъюнктивы, отек век и сужение глазной щели, наблюдают серозно-гнойное истечение.

Возможно использование для постановки биопробы и белых мышей, ко­торых заражают орально, внутривенно или внутрибрюшинно. В зависимо­сти от метода инокуляции псевдотуберкулезного возбудителя, животные погибают на 3-9-е сутки. На вскрытии обнаруживают увеличение печени и селезенки, которые имеют многочисленные некротические очажки, напо­минающие туберкулезные бугорки, но в отличие от них, не подвергающие­ся обызвествлению. Аналогичные абсцессы или узелки обнаруживают и в легких.

К безусловно патогенным Y.enterocolitica относятся бактерии сероваров 03; 04, 32; 05; 05, 27; 06, 30; 07,8; 08; 09 биоваров IIи IV, реже I и III.Наряду с ними выделяется и значительная часть апатогенных иерсиний. При этом принадлежность того или иного штамма к опреде­ленному серологическому и биологическому варианту далеко не всегда подтверждает либо опровергает его этиологическую значимость. Име­ется достаточно сообщений о выделении патогенных штаммов иерсиний серо-биоваров, ранее считавшихся непатогенными, и наоборот. Из-за столь неоднозначной роли различных серобиоваров Y.enterocolitica в патологии животных для правильного решения вопроса о патогенности того или иного штамма, а следовательно, и для правильной постановки диагноза необходимы дополнительные исследования его факторов вирулентности.

Для большинства патогенных штаммов Y. enterocolitica характерны вы­раженные адгезивные свойства, обусловливающие колонизацию возбуди­теля на энтероцитах, а также энтеротоксигенность. Продуцируемый возбу­дителем в больших количествах термостабильный энтеротоксин весьма сходен с таковым энтеротоксигенных неинвазивных эшерихий.

Механизм действия термостабильного энтеротоксина Y.enterocolitica связан с активацией аденилатциклазы в эпителиальных клетках кишечни­ка, что ведет к накоплению циклического гуанозинмонофосфата и наруше­нию водноэлектролитного баланса и энтеросорбции. В реализации дей­ствия энтеротоксина принимают участие и простоглаидины. Наблюдаемая при этом колонизация энтероцитов при минимальной инвазии или ее отсут­ствии подтверждает важную роль энтеротоксина в патогенезе кишечного иерсиниоза. Энтеротоксигенные Y.enterocolitica вызывают у животных и человека диареи различной интенсивности.

Штаммы Y.enterocolitica, обладающие инвазивностью, способностью размножаться в органах и тканях организма хозяина, вызывают генерали зованную инфекцию. Корреляции между эптеротоксигенностью и инвазив­ностью у данного возбудителя не установлено.

В отличие от Y.enterocolitica, у Y.pseudotuberculosis установлены мак­симальная инвазивность, цитотоксичиость и способность к генерализа­ции инфекции. Действие энтеротоксина Y.pseudotuberculosis на слизис­тую оболочку кишечника выражено значительно меньше, чем у Y. enterocolitica.

К настоящему времени установлено, что к возбудителю кишечного иер­синиоза чувствительны некоторые лабораторные животные: гибель морских свинок наблюдается при внутрибрюшном их заражении патогенными иерсиниями в дозе 3х10⁹ мик­робных клеток в течение 24-48 часов. К подкожному введению возбуди­теля животные оказались устойчивы; у морских свинок конъ­юнктивит, а в ряде случаев абортивный кератит при введении патогенных иерсиний серовара 09 в конъюнктивальную полость. При этом штаммы серовара О3 патологической реакции не вызвали.

Лучшими способами заражения являются внутрибрюшное и подкожное введение бактерий. При этих способах аппликации иерсиний в разных опы­тах и для различных сероваров (О3; 08; 09; 06,30) ЛД₅₀ возбудителя со­ставляли от 1,5х10⁷ до 2,5х10⁸ микробных клеток.

При пероральном заражении мышей инфекционный процесс удавалось воспроизвести только при искусственном подавлении иммунитета (бестимусные животные, обработка иммунодепрессантами) либо на мышах-гнотобиотах.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что патогенность Y.enterocolitica для лабораторных животных изучена еще недостаточно. До­полнительную сложность в изучении данного вопроса вызывает циркуляция в природе патогенных иерсиний с различной степенью вирулентности для жи­вотных, включая и лабораторных. Вследствие этого нередко при заражении патогенными иерсиниями лабораторных животных их гибели не наблюдается, поэтому биопроба для проверки патогенности Y. enterocolitica не рекомендует­ся.

Выше упоминалось о том, что патогенность у Y.enterocolitica детерми­нируется плазмидой и сопровождается наличием у таких штаммов ряда культуральных особенностей, которые предложено использовать в качестве мар­керов вирулентности.

 

Определение способности к аутоагглютинации. Феномен аутоагглютинации проявляется при культивировании в жид­кой питательной среде и заключается в спонтанном склеивании клеток иерсиний. Для проверки данной способности в две пробирки со средой Кларка засевают чистую культуру испытуемого штамма Y.enterocolitica, получен­ную на МПА. Посевной материал вносят в количестве 10⁶-10⁸ микробных клеток в объеме 1 см³. Одну из пробирок инкубируют при температуре 37° С, вторую — при 25° С в течение 24-48 часов.

Патогенные иерсинии при температуре культивирования 37° С образу­ют обильный хлопьевидный осадок, а при 25° С — равномерное помутне­ние, при этом возможен небольшой, компактный осадок.

Непатогенные бактерии в обеих пробирках дают рост в виде равномер­ного помутнения при отсутствии хлопьев.

При длительном лабораторном хранении штаммов с частыми пересева­ми и культивированием при 37° С часть изначально патогенных клеток, составляющих популяцию изучаемого штамма, может утрачивать плазми-ду, отвечающую за вирулентность. При наличии в популяции 30-70% та­ких бесплазмидных клеток результаты теста становятся нечеткими. В та­ких случаях его повторяют после предварительного клонирования с целью выделения плазмидосодержащих клонов. Данную операцию можно осуще­ствить при определении кальцийзависимости роста изучаемого штамма, что также относится к одному из маркеров вирулентности у данного вида бактерий.

Определение кальцийзависимости роста. Данный тест основан на том, что у патогенных иерсинии при культиви­ровании их на кальцийдефицитной агаровой среде при температуре 37° С проявляется ограничение роста. Это выражается образованием колоний значительно меньшего диаметра, чем при культивировании на обычных питательных средах или при дефиците ионов Са ++, но при температуре 25° С.

Для определения кальцийзависимости готовят специальную кальцийдефицитную среду на основе коммерческого агара АГВ. На поверхность этой среды в двух чашках Петри засевают культуру испытуемого штамма, выра­щенную в среде Кларка при 25° С. Посев ведут с тем расчетом, чтобы полу­чить рост изолированных колоний (от 100 до 500 клеток на стандартную чашку Петри). Одну чашку инкубируют при 37° С, вторую — при 25° С в течение 48 часов, после чего учитывают результаты теста.

Патогенные иерсинии при 37° С вырастают в виде колоний значитель­но меньшего диаметра, чем на чашке, инкубировавшейся при 25° С. Иног да рост может отсутствовать вовсе. Дополнительное инкубирование та­кой чашки при 25° С в течение 24-48 часов ведет к образованию коло­ний обычного размера.

Непатогенные иерсинии при обеих температурах образуют колонии обычной величины (через 24 часа диаметром 1,0-1,5 мм, через 48 часов — до 1,5-2,0 мм).

При наличии в популяции патогенных иерсинии клеток, утративших плазмиду, детерминирующую факторы патогенности, рост при 37° С отме­чают в виде различного соотношения крупных и мелких колоний.

 

Определение температурозависимой морфологии колоний. Морфологию колоний иерсинии изучают после их 24-48-часового ин­кубирования при 25° С и 37° С на агаре АГВ в чашках Петри.

Учет результатов осуществляют невооруженным глазом или с помощью лупы. Диаметр колоний измеряют окуляр-микрометром.

При 37° С патогенные иерсинии образуют малопрозрачные, желтовато­го цвета, зернистые, выпуклые колонии, диаметр которых, как правило, не превышает 1,0 мм.

При 25° С колонии патогенных штаммов сходны по морфологии и размерам с колониями, образуемыми непатогенными иерсиниями при обеих температурах инкубирования. Они более прозрачны, голубова­того цвета, плоские, маслянистой консистенции, имеют диаметр в 1,5- 3 раза больший, чем у патогенных иерсинии, вырастающих при 37° С.

 

Определение пиразинамидазной активности. Тест основан на способности непатогенных Y.enterocolitica продуцировать пиразинамидазу и отсутствии такой способности у патогенных штаммов.

Для выполнения теста готовят специальную плотную питательную сре­ду с пиразинкарбоксиамидом. В пробирку со скошенной питательной сре­дой высевают культуру испытуемого штамма и инкубируют посевы в тече­ние 48 часов при 25-30° С. По окончании инкубирования на поверхность среды с выросшими колониями наносят 1%-ный водный свежеприготовлен­ный раствор железистого сульфата аммония. Учет результатов теста про­водят через 15 минут.

Колонии непатогенных иерсинии, продуцирующих пиразинамидазу, при­обретают розовую окраску, патогенных — не изменяют своего цвета.

 

Серологическая идентификация вирулентных иерсинии в реакции агглютинации на стекле (РА-СВИ).Вирулентные иерсинии выявляют с помощью диагностической сыворот­ки к вирулентным иерсиниям (СВИ) в РА на стекле.

Комплект для РА с сывороткой диагностической к вирулентным иер­синиям (СВИ) содержит СВИ с рабочим разведением 1:10 и 10 %-ную нормальную кроличью сыворотку («К-» для контроля специфичнос­ти).

Для постановки реакции на обезжиренное предметное стекло наносят
1 каплю СВИ и 1 каплю «К-». В обе капли добавляют по одной петле куль­туры испытуемого штамма, выращенной на МПА при 25-37° С, и расти­рают биомассу до образования гомогенной суспензии. Затем стекло осто­рожно покачивают, наблюдая за результатом реакции.

Положительная РА вирулентных иерсиний с СВИ характеризуется по­явлением крошек агглютината в течение 3 минут. Агглютинат лучше заме­тен на темном фоне при косом освещении. В суспензии с нормальной сыво­роткой («К-») агглютинат образовываться не должен.

При отрицательной реакции в обеих каплях сохраняется равномерная, гомогенная суспензия бактерий.

Реакция агглютинации. Для по­становки РА используют стандартные иерсиниозные антигены, представ­ляющие собой суспензию инактивированных формалином культур эталон­ных штаммов Y.enterocolitica сероваров 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 07,8; 09 и Y.pseudotuberculosis сероваров I и III концентрацией 10 млрд. микробных клеток в 1 см³. Перед постановкой реакции, которую осуще­ствляют методом равных объемов, антигены разводят до рабочей концент­рации 1 млрд/см³ (1:10).

При кишечном иерсиниозе характер гуморального иммунного ответа в значительной степени зависит от тяжести и клинического проявления бо­лезни. Высокие титры антител обнаруживаются при тяжелом поражении суставов и септической форме инфекции. При легком течении, особенно при гастроэнтероколитах, антитела выявляют в более низких титрах, од­нако и в этом случае их уровень часто достигает диагностических величин. Выше упоминалось о наличии у иерсиний общих внутриродовых антигенов и антигенов, обуславливающих перекрестные реакции с рядом энтеробак-терий других родов, бруцеллами. Однако на пике инфекционного процесса уровень видо-серовароспецифических антител, как правило, значительно превышает уровень гетерологичных антител. Этим обусловлен минималь­ный диагностический титр в РА, равный 1:160-1:200. Лучше использо­вать метод парных сывороток крови, при котором достоверным считается 2-4-кратное и более нарастание титров антител. Антитела к Y.enterocolitica начинают выявляться со 2-й недели болезни.

К антигенам антитела в крови появляются уже к концу первой недели болезни, а существенное увеличение титров (1:200 и более) отмечают к на­чалу 3-й недели. Этими сроками определяется необходимость использо­вания, как и при кишечном иерсиниозе, метода парных сывороток при по­становке РА. Через 2 месяца наблюдается снижение концентрации антител, и к 6 месяцам их титры обычно не превышают значений 1:50-1:100.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). В последнее время для серодиагностики иерсиниозов все шире применя­ется РНГА, как тест более чувствительный в сравнении с РА. С этой целью разработаны моновалентные антигенные эритроцитарные диагностикумы к Y.enterocolitica сероваров 03; 05; 07,8; 06,30; 09 и Y.pseudotuberculosis сероваров I и III, двухвалентный диагностикум к сероварам 03 и 09, а также поливалентный диагностикум дополнительно содержащий псевдо­туберкулезный антиген.

РНГА применяют со 2-3-й недели болезни, используя метод парных сывороток. Диагностический титр — разведение сыворотки 1:100 и более.

РНГА с использованием антительных эритроцитарных диагностикумов используется для обнаружения иерсиниозных антигенов в патологическом материале и в объектах внешней среды. Исследуемый материал при этом перед исследованием подращивают 3-5 суток, инактивируют при 56° С и берут для исследования надосадочную жидкость.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для дифференциации специфического иммунного ответа, возникающе­го в острый период иерсиниоза и псевдотуберкулеза, от неспецифических антител используют иммуноферментное определение количественного со­держания IgM и IgG.

В острый период данных заболеваний в сыворотке крови преобладают IgM, которые замещаются IgG к концу первого месяца от начала инфекци­онного процесса. Поэтому обнаружение специфических IgM при однократ­ном исследовании проб крови может с большой долей вероятности под­твердить клинический диагноз.

Используется твердофазный ИФА в пластинах и ДОТ-ИФА.

В первом случае реакцию учитывают визуально по изменению окраски содержимого лунки планшета либо спектрофотометрически по оптической плотности продукта реакции, которая у положительных образцов должна превышать в 2-3 раза таковую в контрольных пробах.

ДОТ-ИФА проводят на нитроцеллюлозных мембранах. Данный вари­ант анализа не уступает по чувствительности твердофазному, но проще его в техническом исполнении. При этом используются микроколичества анти­гена, а результаты оцениваются визуально. Положительным результатом считается появление коричневых точек па фильтрах с исследуемыми образ­цами при отсутствии окрашивания в контроле.

Чувствительность ИФА превышает чувствительность РА и РНГА в 10 раз. Антитела при псевдотуберкулезе выявляются начиная с 3-й недели бо­лезни. Диагностический титр 1:256 и более.

Наибольшие трудности представляет дифференциация иерсиниоза, обусловленного сероваром 09, от бруцеллеза. Это связано с выраженным антигенным родством их возбудителей. В таких случаях, помимо поста­новки серологических реакций Райта, Хеддельсона, Роз-Бенгал на бру­целлез, перспективно применение метода дифференциации иерсиниоза и бруцеллеза по классам иммуноглобулинов (М и G) в ИФА. При этом в качестве специфического антигена используют убитую ацетоном культу­ру Br.abortus. Стандартный антиген представляет собой взвесь убитых ацетоном бруцелл концентрацией 10 млрд./мл. Перед постановкой реак­ции антиген разводят 1:10 (рабочая концентрация 1 млрд./мл) 0,9%-ным раствором натрия хлорида.

Методика приготовления компонентов реакции, техника постановки и учета ИФА изложены в инструкции по применению пероксидазных конъюгатов к иммуноглобулинам М и G, выпускаемым ТОО «Полигност» (Санкт-Петербург).