Технология создания и использования рекомбинантных ДНК
Генная инженерия
Лекция 10.
Законы биоэнергетики клетки (по В. П. Скулачеву).
I закон. Живая клетка избегает использования энергии внешних ресурсов для совершения полезной работы непосредственно.
Прежде чем эта энергия будет использована (утилизирована) клеткой, она должна превратиться в одну из 3 конвертируемых форм: АТФ, протонный потенциал на мембране, натриевый потенциал на мембране.
II закон. Любая живая клетка располагает, по меньшей мере, двумя (из трех перечисленных в первом законе) конвертируемыми формами энергии: АТФ (в цитозоле); протонным или натриевым потенциалом (в мембране).
Например, кишечная палочка (Е. colt) обычно использует все три конвертируемые формы энергии, но при низкой концентрации Н+ в окружающей щелочной среде переходит преимущественно на натриевую энергетику. При этом содержание Na-K-АТФазы в плазмолемме возрастает в 40 раз. Благодаря эффекту обращения Na-K-АТФаза работает как АТФсинтетаза. Так энергетические потребности этой бактерии удовлетворяются двумя конвертируемыми формами: натриевым потенциалом на плазмолемме и АТФ в цитозоле.
В клетках растений натриевый потенциал в обычных условиях не вносит существенного вклада в энергетику. Она обеспечивается АТФ и протонным потенциалом на тилакоидной мембране.
В клетках животных конвертированными формами энергии служат АТФ в цитозоле и протонный потенциал на митохондриальной мембране.
III закон. Клетка способна удовлетворить все свои потребности в энергии, если за счет внешних ресурсов, источником которых является Солнце, образуется хотя бы одна их трех конвертируемых форм энергии, поскольку из нее в клетке могут образовываться другие.
Например, морская бактерия Propinigenium modestus имеет единственную конвертируемую форму энергии − натриевый потенциал на плазмолемме, но путем обращения K-Na-вой помпы возможен синтез АТФ, вследствие чего клетка использует две формы энергии. У морских бактерий доминирует натриевая энергетика. Это не свойственно другим бактериям, а также клеткам растений и животных.
Детальное изучение механизма рекомбинации позволило осуществить в лабораторных условиях синтез новых молекул ДНК, в которых гены одного организма оказываются объединенными с генами другого. Такой синтез явился величайшим достижением молекулярной биологии, приведшим к возникновению нового научного направления — генной инженерии. Генная инженерия дала возможность получать новые искусственные комбинации генов, не встречающиеся в природе.
Большой прогресс был сделан после открытия сайт специфическнх эндонуклеаз, названных в дальнейшем эндонуклеазами рестрикции
Эндонуклеазы рестрикции имеют две характерные особенности: они способны узнавать лишь участки достаточно протяженной нуклеотидной последовательности; они катализируют процесс образования смещенных относительно друг друга разрывов в обеих цепях молекулы ДНК (разрывы наискосок). Эта уникальная особенность эндонуклеаз рестрикции позволила получить фрагменты ДНК с одноцепочечными липкими концами и переносить их из одного организма в другой. Так, Е. соli продуцирует эндонуклеазу рестрикции (ЕсоШ), действующую на последовательность ...СААТТС... и расщепляющую связь между О и А. В составе дуплекса ДНК эта последовательность комплементарна последовательности .... СТТААО ...., другой цепи и в то же время при прочтении ее справа налево она идентична последовательности нуклео-тидов первой цепи. Такой участок молекулы ДНК называется палиндромом(так называют выражения, читающиеся одинаково в обоих направлениях, например: "А роза упала на лапу Азора").
В результате действия фермента ЕсоШ на вновь образованных фрагментах ДНК возникают липкие концы. Один из фрагментов имеет на конце одноцепочечный участок, комплементарный одноцепочечному участку на другом фрагменте. Возникает возможность взаимного узнавания и реконструирования таких фрагментов благодаря взаимодействию комплементарных оснований.
Для переноса в клетку-хозяина фрагмента чужеродной ДНК необходима другая ДНК, способная объединиться с этим фрагментом и осуществить его перенос. Эта ДНК получила название вектора. Функцию вектора способны выполнить ДНК-плазмиды и ДНК-вирусы. Плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой интактные кольцевые ДНК, отделенные от основной хромосомы бактерии. Плазмида гораздо мельче хромосомы, в клетке может находиться до десятка ее копий. Каждая плазмида содержит несколько, а иногда много генов, которые реплицируются, транскрибируются и транслируются независимо от хромосомных генов, но одновременно с ними. Бактерии могут существовать и без плазмид, однако, их присутствие сообщает клетке специфические свойства. Так, многие плазмиды содержат гены, кодирующие синтез ферментов, способных разлагать антибиотики и обеспечить устойчивость бактериальной клетки к ним. Такие плазмиды важны как маркеры при скрининге (отборе) трансформированных клеток, образовавшихся в процессе эксперимента по получению рекомбинантных ДНК.
В качестве вирусного вектора заслуживает внимания ДНК фага X. Она легко переносит чужеродный ген в Е. соli. Если ДНК фага X, несущую чужеродный ген, смешать с белком оболочки этого фага, то образуются фаговые частицы, весьма эффективно инфицирующие клетку-хозяина.
Технология создания и использования рекомбинантных ДНК включает следующие основные этапы:
1) получение целевого гена;
2) соединение этого гена с вектором (получение рекомбинантной ДНК);
3) введение рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина;
4) отбор клеток, содержащих целевой ген; клонирование гена.
Получение целевого гена основано на использовании фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы), осуществляющей синтез ДНК с использованием в качестве матрицы РНК. Клетки, интенсивно синтезирующие целевой ген и его мРНК, лизируют: освободившиеся полирибосомы (полисомы) собирают центрифугированием и их обрабатывают антигенами против того белка, ген которого необходимо выделить. Полирибосомы вместе с синтезированным ими белком дают нерастворимый комплекс с антигеном, откуда выделяют мРНК. Ее используют в качестве матрицы для синтеза гена с помощью обратной транскриптазы.