Основные механизмы регуляции функционирования оперона прокариот

Гены-регуляторы являются важными элементами оперона. Под действием клеточных факторов они обусловливают синтез регуляторных белков. Такие белки, соединяясь с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК (оператором), могут способствовать или препятствовать присоединению РНК-полимеразы к промотору. В случае если белок регулятор не дает возможность ферменту присоединяться к промотору (слайд 2Б), он называется репрессором. В этом случае осуществляется негативный контроль транскрипции со стороны гена-ре­гулятора. В случае если белок-регулятор способствует присоединению РНК-полимеразы к промотору и началу процесса транскрипции, его называют белком-активатором, и осуществляется позитивный контроль со стороны гена-регулятора (слайд 2В).

В процессах регуляции экспрессии генов принимают участие так­же вещества небелковой природы (эффекторы), взаимодействующие с белками-регуляторами и изменяющими их способность связываться с опероном. Например, конечный продукт метаболической цепи. В за­висимости от результатов такого воздействия среди эффекторов раз­личают индукторы, способствующие транскрипции, и корепрессоры, препятствующие ей.

Функционирование лактозного оперона Е.соli

В своих экспериментах Джакоб и Моно обнаружили, что добавление лактозы к культуре Е.соli индуцирует образование сразу трех белков-ферментов: галактозидазы, пермеазы и трансацетилазы, необходимых клетке для расщепления лактозы до глюкозы и галактозы. Гены, кодиру­ющие эти ферменты, соседствуют друг с другом в хромосоме. Их назвали структурными генами, или цистронами (слайд 3).

Схема функционирования лактозного оперона E.coli

 

Они одновременно транскрибируются РНК-полимеразой в длинную одиночную мРНК, которая имеет кодоны для всех трех ферментов. мРНК, транскрибиру­емая из нескольких генов, называется полицистронной. Способность к транскрипции этих цистронов контролируется участком молекулы ДНК — оператором. Операторный локус — это определенный участок оперона, имеющий определенную последовательность нуклеотидов, длиной 27 пар оснований. Этот сегмент ДНК располагается в области промотора, к которому перед началом транскрипции присоединяется РНК-полимераза. Промотор расположен перед началом первого струк­турного гена β-галактозидазы. Цистрон «синтезирует» мРНК, когда оператор включен и прекращает синтез, когда он «выключен». Оператор включается или выключается белком, называемым репрессором. Его синтез контролируется регуляторным геном. Репрессор либо связыва­ется с оператором, подавляя его активность, либо не связывается с ним, позволяя проявление активности структурных генов. Таким образом, репрессор является негативным регулятором.

На слайде 3 представлена схема функционирования лактозного оперона. Репрессия (I). При отсутствии индуктора (лактозы), репрессор связывается с оператором и блокирует транскрипцию, в этом случае ферменты не образуются. Индукция (II). Лактоза индуцирует транс­крипцию генов, т.к. инактивирует репрессор. К промотору присоеди­няется РНК-полимераза и начинается транскрипция генов А, В и С. В результате образуются необходимые в данных условиях ферменты. Синтез Ферментов может не только индуцироваться, но и подавляться.

Например, в результате какой-то цепи реакций в клетке образуется ко­нечный продукт Д в большем, чем это необходимо клетке, количестве. Это может нарушить нормальный ход реакций обмена, поэтому в клетке возникает необходимость остановить данный процесс. Тогда вещество Д вступает в реакцию с соответствующим белком-репрессором и пере­водит его в активное состояние. После этого происходит присоединение репрессора к оператору, тем самым выключается вся система оперона и синтез ферментов прекращается. В данном случае, торможение син­теза производится конечным продуктом, образующимся в результате реакции. Такой механизм действия называется регуляцией по принципу обратной связи (слайд 3-I).

Описанный механизм регуляции имеет большое приспособительное значение. Например, согласно имеющейся генетической программе, кишечная палочка может синтезировать несколько десятков ферментов, расщепляющих различные вещества, так как состав среды, окружающей бактерии, очень изменчив. В этих условиях постоянное образование всего набора ферментов было бы неэкономичным для клетки, так как нецелесообразно продуцировать одновременно 60-80 ферментов, из которых в данных условиях среды могут понадобиться лишь 6-8. Поэтому синтез ненужных в этих условиях ферментов блокирован, а клетки образуют лишь несколько необходимых белков. В природе отбор идет по принципу наибольшей экономии материи и энергии, поэтому клет­ки, функционирующие более экономично, лучше приспосабливаются и быстрее размножаются. Это и привело к совершенствованию системы регуляции метаболизма.

Особенности экспрессии генов у эукариот

Принципы регуляции экспрессии одинаковы как у прокариот, так и у эукариот. Однако эукариоты, особенно многоклеточные, — более сложные организмы и экспрессия их генов сложнее и несколько отли­чается деталями. В частности, можно отметить следующие особенности экспрессии у эукариот:

1. Геном высших эукариот значительно сложнее. Например, гапло­идный геном человека имеет приблизительно 35 тысяч генов, располо­женных в 24 (22 аутосомы + X и Y) хромосомах. А у прокариот имеется
только одна хромосома и несколько сотен генов.

2. В клетках эукариот ядерная оболочка пространственно разделяет
процессы транскрипции и трансляции, хромосомы находятся в ядре,
а рибосомы — в цитоплазме. Экспрессия генов у эукариот включает
гораздо большее число этапов. Поэтому у них есть ряд механизмов ре­гуляции, отсутствующих в клетках прокариот, например, процессинг.

3. На экспрессию эукариотических генов оказывает влияние ампли­фикация генов. Это многократное увеличение числа копий одинаковых
генов с целью интенсификации синтеза молекул, нужных в определен­ный момент времени. Например, повторяющиеся последовательности
ДНК включают сотни копий генов рРНК и тРНК.

4. В отличие от прокариот, структурные гены эукариот имеют про­должительные последовательности азотистых оснований, которые не
кодируют аминокислот — интроны. Между ними расположены после­довательности, которые кодируют аминокислоты — экзоны. Транскри­бируемая из гена РНК имеет как интроны, так и экзоны. Она называется
про-мРНК. Ее интронные области удаляются нуклеазами, а несущие
информацию участки — экзоны соединяются вместе. Процесс обработки
про-мРНК и превращение ее в мРНК известен как процессинг.

5. У эукариот не установлено полной оперонной организации гене­тического материала. Гены ферментов определенной метаболической
цепи могут быть расположены в различных хромосомах. Они обычно
не имеют общей системы регуляции в виде гена регулятора, оператора и промотора. Поэтому синтезируемые в ядрах эукариот мРНК моноцистронны. Регуляция активности генов у эукариот сложнее, т.к. в этом процессе участвуют сразу несколько генов-регуляторов, то есть регу­ляция транскрипции эукариот является комбинативной. Например, у эукариот на молекуле ДНК имеется специальная область около про­мотора. Эта область имеет около 100 пар специальных нуклеотидов (препромоторный элемент). К этому участку молекулы присоединяется особый белок — фактор транскрипции. Это обеспечивает успешное присоединение РНК-полимеразы II к промотору.

6. Еще одна особенность генома эукариот — наличие специальных
«усиливающих» сегментов ДНК — энхансеров. Они могут располагаться на большом расстоянии от промотора. Их функцией является
участие в регуляции активности структурных генов. В свою очередь
и препромоторный элемент, и энхансер регулируется соответствующи­ми регуляторными белками. Некоторые белки-регуляторы обладают
координирующим влиянием на активность многих генов, то есть они
обладают плейотропным действием.

7. Геном эукариот подчиняется регуляторным воздействиям со
стороны эндокринной системы организма. Многие гормоны являются
индукторами транскрипции. В первую очередь это относится к стероид­ным гормонам, которые обратимо связываются с белками-рецепторами,
переносящими их в ядро. Такой комплекс связывается со специфиче­ским участком хроматина, ответственным за регуляцию генов. Напри­мер, действие тестостерона активизирует гены, определяющие развитие
организма по мужскому типу.

8. Еще одна особенность регуляции активности генов эукариот
связана с образованием хроматина — комплекса ДНК с белками.
В таком виде гены в составе нуклеосом неспособны к транскрипции.
Поэтому необходимым условием является частичная декомпактизация хроматина и ослабление связей с гистоновыми белками. Однако
полная нуклеосомная организация хроматина в ходе транскрипции не
утрачивается.

9. Контроль экспрессии генов у эукариот осуществляется также на
стадии трансляции, например, путем воздействия на фактор инициации
трансляции. Поэтому даже при наличии в цитоплазме мРНК синтез на
ней может не происходить.

10. Некоторые гены эукариот многократно повторены, а определен­ные же участки ДНК вообще не играют генетической роли, например,
сателитная ДНК. Геном эукариот «избыточен». Например, у человека
функционирует 2-3 % из 35 000 всех генов. Кроме этого, в геномах эукариот содержатся последовательности, повторяющиеся несколько десятков, сотен и даже миллионов раз. Среди повторяющихся последо­вательностей имеются элементы с непостоянной локализацией. Их на­зывают транспозонами, или мобильными элементами. Повторяющиеся последовательности выполняют разнообразную биологическую роль: регуляция воспроизведения ДНК, участие в кроссинговере, обозначение границы между экзонами и нитронами и др.

11. Регуляция экспрессии может осуществляться на стадии пострансляционных изменений (модификация). Например, для образования
активной формы белкового гормона инсулина из молекулы проинсулина
вырезаются две цепочки, которые затем сшиваются дисульфидными
связями.

12. В процессе синтеза одного белка участвует не один, а много
генов. В частности, один или несколько структурных генов, образу­ющих мРНК, примерно 20 генов тРНК, необходимых для переноса
20 различных аминокислот (мономеров белков) и несколько генов
рРНК, образующих рибосомы. Функционируют также много других
структурных генов: различных ферментов процессинга, трансляции,
модификации и т. д.

Итак, очевидно, что экспрессия гена в признак эукариот — очень сложный процесс, который регулируется на многих уровнях (слайд 4), в том числе другими генами. Таким образом, любой признак эукариотического организма является полигенным.

Схема, иллюстрирующая шестъ уровней, на которых может осуществля­ется контроль экспрессии генов у эукариот:

1 — контроль на уровне транскрипции;

2 — контроль на уровне процессинга;

3 — контроль на уровне транспорта;

4 — контроль на уровне трансляции;

5 — контроль на уровне деградации;

6 — контроль на уровне модификации

 

Современное состояние теории гена

В результате исследований элементарных единиц наследственно­сти сложились представления, носящие общее название теории гена. Основные положения этой теории следующие:

1. Ген - участок молекулы ДНК, имеющей определенную последо­вательность нуклеотидов. Представляет собой сложную функциональ­ную единицу наследственной информации, состоящую из различных
функциональных сегментов.

2. Разные гены имеют разный качественный и количественный со­
став нуклеотидов.

3. Каждый ген имеет определенное место (локус) в хромосоме.

4. Гены способны к рекомбинации (в процессе кроссинговера) и му­
тации, что обеспечивает изменчивость.

5. В хромосоме есть гены мРНК (структурные гены), гены рРНК
и гены тРНК.

6. Среди структурных генов есть регуляторные гены, продукты
которых регулируют работу других структурных генов.

7. Ген не принимает непосредственного участия в синтезе белков, он
является матрицей для образования посредников — различных молекул
РНК, непосредственно участвующих в синтезе.

8. Количество генов может удваиваться в процессе репликации,
а затем распределяться в дочерние клетки в результате митоза или
мейоза.

9. Ген может существовать в виде нескольких аллелей, определяю­щих варианты признаков.

10. Определенный структурный ген кодирует синтез одного полипеп­тида. Отдельный белок может обусловливать определенный признак.
Этим обусловлены моногенные признаки.

11. Клетка, орган или организм обладают многими сложными при­
знаками, которые слагаются из взаимодействия многих генов - это
полигенные признаки.

12. Действие гена строго специфично, т. к. ген может кодировать
только одну аминокислотную последовательность и регулирует синтез
одного конкретного полипептида.

13. Некоторые гены обладают плейотропностъю действия (см.
главу 5), определяя развитие сразу нескольких признаков.

14. Дозированностъ действия гена заключается в зависимости ин­тенсивности проявления признака (экспрессивность) от количества определенного аллеля. Например, многие заболевания в гетерозиготном состоянии проявляются слабее, чем в гомозиготном.

15. На активность гена может оказать влияние как внешняя, так
и внутренняя среда.

16. Конститутивные гены - это гены, которые постоянно экспрессируются, так как белки, которые они кодируют, необходимы для
постоянной клеточной деятельности, обеспечивают синтез белков
«домашнего хозяйства» - белков рибосом, цитохромов, ферментов
гликолиза, переносчиков ионов и др. Эти гены не требуют специальной
регуляции.

17. Неконститутивные гены - это гены обычно неактивные, но
экспрессирующиеся только тогда, когда белок, который они кодируют,
нужен клетке. Эти гены регулируются клеткой или организмом. Эти
белки обеспечивают дифференцировку, специфичность структуры
и функций каждой клетки.

18. Молекулы ДНК способны к репарации, поэтому не всякие по­вреждения гена ведут к мутациям.

19. Генотип, будучи дискретным (состоящим из отдельных генов),
функционирует как единое целое.

Взаимосвязь между генами, ферментами и признаками

Тесная взаимосвязь между генами и ферментами была известна задолго до того, как был установлен механизм экспрессии гена. Она была обнаружена в 1909 г. британским врачом А.Гарродом. Он пред­положил, что заболевания, наследуемые потомками от родителей, могут быть вызваны недостатком ферментов, которые катализируют превращение одного метаболического вещества в другое. Он назвал такие заболевания «врожденными ошибками метаболизма». Недоста­ток фермента связан с отсутствием нормальной аллели гена, который контролирует синтез данного фермента. Эта концепция в 1945 г. была положена в основу гипотезы Дж. Бидла и Э. Татума: один ген — один фермент. Это положение утверждает, что каждый ген контролирует синтез своего белка. Но некоторые белки содержат более чем одну полипептидную цепь, например, гемоглобин состоит из 2-х α- и 2-х β-полипептидных цепей. Значит, образование сложного бел­ка требует участие нескольких генов. Таким образом, гипотеза была уточнена: один ген — одна полипептидная цепь. Результатом участия белков в метаболизме является развитие признака или признаков организмов. Весь процесс от биосинтеза РНК и до проявления свойств белков можно представить в виде следующей цепи событий:

ДНК про-мРНК мРНК полипептидная цепь белок

признак.

В результате «работы» генов образуются функционально активные белки или их гликолипидопротеиновые комплексы, которые включают­ся в метаболизм, либо секретируются (выводятся) из клеток. С током крови они поступают к другим органам и выполняют там определенную роль: ферментативную, регуляторную или структурную. Например, гормон инсулин синтезируется как более крупная молекула — проинсулин, не имеющий активности. В процессе модификации в аппарате Гольджи ненужная часть молекулы отцепляется, а две образующиеся полипептидные цепи сшиваются ферментами. Гормон приобретает определенную структуру и функциональную активность. Его актив­ность обеспечивает наличие признака организма — постоянство глюкозы в крови человека.