БИООКИСЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ

Схема 9: Применение гидроцилиндра с кольцевыми проточками.

Схема 8: Применение сдвоенных гидроцилиндр.

Схема 7: Применение дросселя с обратным клапаном.

Данная схема позволяет осуществлять определенный цикл работ.

ИП

р.п.

Величина скорости определяется положением распределителя с магнитом Y1.

Такая схема применяется при больших нагрузках на исполнительном устройстве, в этом случае целесообразно применение 2-х цилиндров. Заданные v могут быть обеспечены за счет выбора размеров 2-х гидроцилиндров. Схема не дает возможности обеспечить регулируемое соотношение скоростей.

Применен плунжер гидроцилиндра во втулке которого выполнено две кольцевые проточки, к которым подключены две гидролинии.

ИП

Схема не требует настроечных опреаций.

Недостатком является:

1) Применимость для конкретного технического процесса заданными расстояниями при которых должна переключиться скорость.

2) Сложность уплотнения плунжерных гидроцилиндров. Уплотнение обеспечивает герметичность самой плунжерной пары.

Схема 10: Применение сдвоенных насосов с разделительной панелью.

В разделительную панель входят: напорный клапан Р1, клапан последовательности настроенный на давление Р2 и обратный клапан.

При рабочем перемещение жидкость проходит через дроссель обеспечивающий регулирование скорости. Так как Р1 > Р2, то под действие давления клапан будет открыт то подача 2-го насоса будет сливаться на слив т. е. Р2 = 0. Подача малого насоса исходя из рабочего перемещения.

При Р2 закрыт, подача 2-го насоса через обратный клапан объединяется с 1-ым насосом и суммарная подача отправляется в гидросистему, обеспечивая ускоренную скорость холостого перемещения.

Данная схема обеспечивает экономный режим работы за счет отключения 2-го большого насоса. Электромагнит Y3 обеспечивает авторазгрузку гидросистемы от давления в периоды когда не требуется перемещение исполнительных устройств.

Гликолиз

Гликолиз – центральный путь катаболизма глюкозы. При гликолизе высвобождается только небольшая часть всей энергии, заключенной в молекуле глюкозы, гликолиз обеспечивает получение энергии из глюкозы без ее окисления полностью. Общий выход АТФ в процессе гликолиза равен 2 молекулам на каждую молекулу глюкозы.

В анаэробных условиях гликолиз – единственный процесс в организме животных, растений и многих микроорганизмов, приводящий к образованию АТФ; в организме человека и животных гликолиз позволяет поддерживать интенсивную работу скелетной мышцы в условиях недостатка кислорода.

Гликолиз включает химические превращения трех разных типов:

а) распад углеродного скелета глюкозы до пирувата – путь атомов углерода;

б) фосфорилирование АДФ высокоэнергетическими фосфорилированными соединениями с образованием АТФ – путь фосфатных групп;

в) перенос водородных атомов или электронов – путь переноса электронов.

В общем плане в процессе гликолиза происходит расщепление шестиуглеродной молекулы глюкозы на две трехуглеродные молекулы пирувата при участии десяти ферментов. На первой стадии углеродные цепочки всех метаболизируемых гексоз превращаются в один общий продукт – глицеральдегид-3-фосфат. На второй стадии энергия, высвобождающаяся при превращении двух молекул глицеральдегид-3-фосфата в две молекулы пирувата, запасается в виде 4 молекул АТФ.

Все девять промежуточных продуктов гликолиза представляют собой фосфорилированные соединения. Фосфатные группы выполняют 3 функции:

1) При рН 7 они полностью ионизированы, и потому они придают каждому из промежуточных продуктов гликолиза суммарный отрицательный заряд. Поскольку клеточные мембраны обычно непроницаемы для молекул, несущих электрический заряд, промежуточные продукты гликолиза не могут выйти из клетки. Глюкоза попадает внутрь клетки, а лактат и пируват покидают их только благодаря тому, что в клеточных мембранах имеются особые транспортные системы, способные переносить молекулы именно этих соединений.

2) Фосфатные группы передаются на АДФ с образованием АТФ,

3) Фосфатные группы выполняют функцию узнавания; это связывающие группы, благодаря которым молекулы промежуточных продуктов гликолиза занимают правильное положение относительно активных центров соответствующих ферментов.

Почти все гликолитические ферменты нуждаются в ионах магния для правильного связывания промежуточных продуктов с субстратным центром.

Отдельные стадии гликолиза:

Первая реакция – необратимое фосфорилирование глюкозы гексокиназой с образованием глюкозо-6-фосфата, донором фосфатной группы является АТФ:

Гексокиназа специфична для D-глюкозы, D-фруктозы и D-маннозы. Связывание гексокиназы с гексозой происходит по типу индуцированного соответствия, субстратом для нее служит MgАТФ^2-. Глюкозо-6-фосфат является аллостерическим ингибитором гексокиназы.

Гексокиназа представлена различными изоформами для разных органов и тканей. Мышечная гексокиназа фосфорилирует глюкозу крови с максимальной скоростью и резко ингибируется глюкозо-6-фосфатом. В печени форма фермента получила название глюкокиназы и отличается от всех других изоформ тремя особенностями: 1) она специфична только для D-глюкозы и не действует на другие гексозы; 2) глюкозо-6-фосфат не является для нее ингибитором; 3) она фосфорилирует глюкозу только при ее заметном возрастании в крови – после приема пищи – и переводит ее в глюкозо-6-фосфат для отложения в запас в виде гликогена.

Вторая реакция – обратимая изомеризация глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат, катализируемая глюкозо-6-фосфатизомеразой:

Третья реакция – необратимая реакция фосфорилирования фруктозо-6-фосфата молекулой АТФ до фруктозо-1,6-дифосфата с помощью фермента фосфофруктокиназы:

Фосфофруктокиназа – главный регуляторный фермент гликолиза в мышцах, когда в клетке иссякает запас АТФ и накапливается АМФ и АДФ, активность ее возрастает.

Четвертая реакция – обратимая реакция расщепления связи С-С во фруктозо-1,6-дифосфате на две триозы (дигидроксиацетонфосфат и глицеральдегид-3-фосфат), катализируемая альдолазой:

Реакция обратима, но в клетках ее направление сдвинуто вправо, так как продукты реакции быстро вовлекаются в дальнейшие превращения.

Пятая реакция – обратимая реакция кето-альдозной изомеризации дигидроксиацетонфосфата в глицеральдегид-3-фосфат, катализируемая ферментом триозофосфатизомеразой:

Так как в следующие реакции включается только глицеральдегид-3-фосфат, то равновесие этой реакции смещено вправо. Таким образом, каждая молекула глюкозы дает две триозы, которые включаются во вторую стадию гликолиза.

Шестая реакция – обратимое окисление глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата, которая катализируется ферментом глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой. Реакцию окисления глицеральдегид-3-фосфата принято называть реакцией гликолитической оксидоредукции:

В результате реакции получается смешанный ангидрид фосфорной и 3-фосфоглицериновой кислот – 1,3-дифосфоглицерат. Такого типа ангидрид, называемый ацилфосфатом, характеризуется макроэргической связью. Механизм действия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы довольно сложен. Сначала субстрат взаимодействует с SH-группой остатка цистеина, играющего важную роль в активном центре фермента. Затем фермент катализирует перенос гидрид-иона от ковалентно связанного субстрата на НАД⁺, также прочно связанный с его активным центром. В ходе этого процесса возникает высокоэнергетический ковалентный ацилферментный комплекс. Этот комплекс взаимодействует с неорганическим фосфатом, в результате чего образуется свободный 1,3-дифосфоглицерат и регенерирует свободный фермент. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа ингибируется иодацетатом, который связывает важную функциональную SH-группу фермента и тем самым лишает его возможности осуществлять катализ.

Седьмая реакция – обратимая реакция субстратного фосфорилирования АДФ и образования АТФ, при которой происходит перенос богатого энергией фосфорильного остатка с 1,3-дифосфоглицерата на АДФ при помощи фермента фосфоглицераткиназы:

Восьмая реакция – обратимая реакция изомеризации 3-фосфоглицерата в 2-фосфоглицерат, катализируемая ферментом фосфоглицератмутазой:

Девятая реакция – обратимая реакция енолизации, в процессе которой с помощью фермента енолазы происходит отщепление молекулы воды от 2-фосфоглицерата, что приводит к образованию макроэргической связи в фосфоенолпирувате:

Для енолазы характерно ингибирование фторидом в присутствии фосфата, истинным ингибитором являются при этом ионы фторфосфата, связывающие ионы магния.

Десятая реакция – необратимая реакция еще одного субстратного фосфорилирования АДФ и образования АТФ, при которой происходит разрыв высокоэнергетической связи и перенос остатка фосфорной кислоты от фосфоенолпирувата на АДФ. Катализируется эта реакция пируваткиназой:

Продукт реакции пируват образуется в енольной форме, однако эта енольная форма быстро переходит неферментативным путем в кетоформу, доминирующую при рН 7,0:

Равновесие этой реакции очень сильно сдвинуто вправо и это в соответствии с законом действующих масс «тянет» вправо также и предшествующую пируваткиназную реакцию. В условиях клетки пируваткиназная реакция практически необратима.

Суммарное уравнение гликолиза:

Глюкоза + 2Pi + 2АДФ + 2НАД⁺ → 2Пирувата + 2АТФ + 2НАДН₂ + 2Н₂О

Не только глюкоза, но и многие другие углеводы вовлекаются после ряда превращений в гликолиз – гликоген и крахмал, мальтоза, лактоза и сахароза, фруктоза, манноза и галактоза.

D-глюкозные единицы боковых цепей гликогена и крахмала вовлекаются в гликолиз в результате последовательного действия двух ферментов. Гликоген-фосфорилаза (или фосфорилаза крахмала) удаляет концевой остаток глюкозы на нередуцирующем конце одной из цепей гликогена с образованием α-D-глюкозо-1-фосфата. Этот процесс многократно повторяется, пока гликоген-фосфорилаза не дойдет до точки, отстоящей на четыре глюкозные единицы от α(1→6) связи. Здесь ее действие прекращается. Дальше начинает действовать другой фермент от α(1→6)-глюкозидаза. Он катализирует две реакции. В первой из них он отщепляет от цепи три глюкозных остатка из упомянутых четырех и переносит их на конец какой-нибудь внешней боковой цепи. Во второй реакции он отщепляет четвертый глюкозный остаток, присоединенный к точке ветвления α(1→6)-связью. Гидролиз α(1→6)-связи в точке ветвления приводит к образованию одной молекулы глюкозы и открывает для гликоген-фосфорилазы новый участок цепи из остатков глюкозы, соединенных α(1→4)-связями.

Глюкозо-1-фосфат превращается в глюкозо-6-фосфат под действием фермента фосфоглюкомутазы:

Для действия фосфоглюкомутазы необходим в качестве кофактора глюкозо-1,6-дифосфат. Реакция идет в две стадии: сначала присоединяется фосфат к С6 – получается глюкозо-1,6-дифосфат, далее отщепляется фосфат из С1 – получается глюкозо-6-фосфат.

Фосфоглюкомутаза является представителем обширного класса ферментов, у которых в активном центре присутствует остаток серина. Именно этот остаток этерифицируется фосфорной кислотой. Ферменты серинового класса необратимо ингибируются некоторыми органическими фосфатами. При этом ингибиторы взаимодействуют с ОН-групой остатка серина, в результате чего образуется фосфорилированное производное фермента, лишенное каталитической активности.

D-фруктоза фосфорилируется гексокиназой с образованием фруктозо-6-фосфата, который далее превращается по схеме гликолиза:

D-манноза фосфорилируется по положению С6 под действием гексокиназы с образованием маннозо-6-фосфата. Затем фосфоманнозоизомераза катализирует изомеризацию D—маннозо-6-фосфата с образованием D-фруктозо-6-фосфата, который принадлежит к числу промежуточных продуктов гликолиза:

D-галактоза сначала фосфорилируется по С1 под действием фермента галактокиназы за счет АТФ с образованием галактозо-1-фосфата:

Далее галактозо-1-фосфат взаимодействует с УДФ-глюкозой, что приводит к образованию УДФ-галактозы и глюкозо-1-фосфата. Остаток галактозы в молекуле УДФ-галактозы претерпевает затем эпимеризацию при С4, в результате чего образуется УДФ-глюкоза. УДФ-глюкозо-пирофосфатаза катализирует расщепление УДФ-глюкозы с образованием глюкозо-1-фосфата. Глюкозо-1-фосфат под действием фосфоглюкомутазы превращается в глюкозо-6-фосфат и далее расщепляется по пути гликолиза. Эта последовательность реакций ответственна и для обратного процесса – для синтеза D-галактозы в молочных железах.

Дисахариды сами по себе не способны включаться в гликолиз. Если ввести их непосредственно в кровь, то они не будут утилизироваться. Они должны сначала подвергнуться ферментативному гидролизу в клетках, выстилающих кишечник: мальтаза расщепляет мальтозу на две молекулы глюкозы, сахараза расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу, лактаза расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу.

Полисахариды, не хранящиеся в клетке в качестве топлива, а поступающие в организм с пищей, должны первоначально гидролизоваться до моносахаридов, чтобы проникнуть в клетку. В природе найдено несколько различных гидролаз, катализирующих гидролиз крахмала и фосфоролиз гликогена:

1) γ-амилаза (глюкоамилаза) – отщепляет остатки глюкозы от невостанавливающего конца молекулы по (1→4)-связям. Неспецифична, расщепляет и гликоген, и другие полисахариды. Не расщепляет (1→6)-связи. Найдена в почках и печени животных и у плесневелых грибов.

2) β-амилаза – гидролизует крахмал по (1→4)-связям, отщепляя остатки мальтозы в β-форме с нередуцирующего конца, не работает в точках ветвления. Характерна только для высших растений.

3) α-амилаза – беспорядочно гидролизует (1→4)-связи крахмала с образованием преимущественно α-мальтозы. Найдена у всех животных, растений, грибов и бактерий.

4) Амило-1,6-глюкозидаза – гидролизует (1→6)-связи у животных, у растений называется R-энзимом, у микроорганизмов – изоамилазой.

Вовлечение остатков глюкозы в процесс гликолиза регулируется гексокиназой (глюкокиназой или гликоген-фосфорилазой). Сама последовательность гликолиза регулируется на двух главных этапах: фосфофруктокиназной и пируваткиназной реакциях.

Фосфофруктокиназа – это сложный аллостерический фермент, управляемый многими положительными и отрицательными модуляторами. Механизмам его регуляции (у разных клеток различным) посвящены сотни научных статей. Самыми активными активаторами фосфофруктокиназы являются АМФ и фруктозо-1,6-дифосфат, самыми активными ингибиторами – АТФ и цитрат. Всякий раз, когда концентрация АТФ падает, а энергии требуется больше, фосфофруктокиназная активность усиливается, даже если концентрация фруктозо-6-фосфата очень низка. Если уровень АТФ в клетке высок, то фосфофруктокиназа будет катализировать реакцию только при высокой концентрации фруктозо-6-фосфата.

Пируваткиназа встречается по меньшей мере в трех изоформах, которые отличаются друг от друга по распределению в тканях и по реакции на различные модуляторы. Когда в клетке уже велика концентрация АТФ или когда в ней достаточно другого топлива для процесса дыхания, обеспечивающего клетку энергией (ацетил-СоА или жирных кислот), гликолиз ингибируется за счет либо фосфофруктокиназы, либо пируваткиназы в зависимости от условий. В то же время при низких концентрациях АТФ сродство пируваткиназы к фосфоенолпирувату возрастает, даже если его концентрация будет низкой.

Гликолиз – древнейший катаболический путь, занимающий центральное место в метаболизме любой клетки, и во всех клетках гликолиз регулируется с очень высокой эффективностью. При определенных метаболических ситуациях клетке выгоднее регулировать скорость гликолиза за счет скорости вовлечения в гликолиз остатков глюкозы. В других случаях более выгодной для клетки может оказаться регуляция через фосфофруктокиназную или пируваткиназную реакции. Наличие нескольких регуляторных пунктов обеспечивает клетке большую метаболическую гибкость.

Дальнейшая судьба пирувата в организме:

1. В аэробных условиях полное окисление пирувата в цикле Кребса.

2. В анаэробных условиях – различные виды брожений.

Брожение

Брожение – это такой тип энергетических процессов, при котором органические вещества, подвергающиеся химическим превращениям, сами служат донорами и акцепторами электронов. Молекулярный кислород в этих процессах не участвует.

Запасание энергии при брожениях происходит либо путем субстратного фосфорилирования с образованием АТФ, либо путем формирования трансмембранной разницы потенциалов за счет экскреции неорганических ионов или кислых продуктов брожения. Существует большое разнообразие типов брожения, которые обычно получают название по главному конечному продукту – спиртовое, молочнокислое, маслянокислое, пропионовокислое, муравьинокислое, ацетоно-бутиловое.

Молочнокислое брожение осуществляется в скелетных мышцах в условиях анаэробиоза и молочнокислыми бактериями, например Streptococcus cremoris. Образовавшийся в результате гликолиза пируват с помощью фермента лактатдегидрогеназы восстанавливается в L-лактат:

Регенерация двух молекул НАД⁺ в результате восстановления двух молекул пирувата до лактата означает, что НАД⁺ может использоваться в процессе гликолиза многократно.

Лактатдегидрогеназа представлена пятью различными изоформами, отличающимися друг от друга по активности и степени аллостерического ингибирования пируватом.

Суммарное уравнение молочнокислого брожения:

Глюкоза + 2Pi + 2АДФ → 2Лактата + 2 АТФ + 2Н₂О.

Спиртовое брожение характерно для дрожжей и некоторых других микроорганизмов. После образования пирувата протекает в две реакции. Сначала пируват теряет свою карбоксильную группу под действием пируватдекарбоксилазы и превращается в ацетальдегид:

Далее ацетальдегид восстанавливается до этанола за счет НАДН₂, образовавшегося при окислении глицеральдегид-3-фосфата. Эта реакция катализируется алкогольдегидрогеназой:

Суммарное уравнение спиртового брожения имеет вид:

Глюкоза + 2Pi + 2АДФ → 2Этанола + 2СО₂ + 2АТФ + 2Н₂О.

Варианты спиртового брожения:

1. Если в культуру бродящих дрожжей добавить бисульфит, то ацетальдегид им связывается и блокируется образование этанола. Дрожжи приспосабливаются, используя НАДН₂ для восстановления триозофосфата в глицеринфосфат. Суммарное количество АТФ при этом становится равным нулю, однако фосфатаза превращает глицеринфосфат в глицерин и это используют при промышленном получении глицерина.

2. Если дрожжи выращивать в щелочной среде, то они окисляют ацетальдегид НАД-зависимой дегидрогеназой в ацетат. НАДН₂ используется для восстановления триозофосфатов в глицерофосфат. Образующаяся уксусная кислота нейтрализует щелочь, при рН среды близкой к нейтральной стандартный процесс спиртового брожения возобновляется.

3. Кишечные бактерии, в том числе E.coli и Shigella, превращают глюкозу в этанол, уксусную кислоту и муравьиную кислоту.

Пропионовокислое брожение осуществляют бактерии, живущие в рубце жвачных животных. Они гидролизуют целлюлозу до глюкозы, далее до пирувата, который превращают в уксусную и пропионовую кислоты:

1) Пируват → ацетил-СоА → ацетат.

2) Пируват → оксалоацетат → малат → сукцинат → сукцинил-СоА → метилмалонил-СоА → пропионил-СоА → пропионат.

Из 3 молекул пирувата получается 2 молекулы пропионата, 1 молекула ацетата, Н₂О и СО₂. Выход АТФ оказывается равным 3 молекулам АТФ на 1 молекулу глюкозы.

Маслянокислое брожение осуществляется бактериями рода Clostridium по уравнению:

2Глюкозы + 2Н₂О → Бутират + 2Ацетата + 4СО₂ + 6Н₂.

Выход АТФ составляет 3,5 молекулы на 1 молекулу глюкозы.

Бутанольное брожение осуществляют обитающие в рубце бактерии Eubacterium и Butyrivibrio:

2Глюкозы → Бутанол + Изопропанол + 5СО₂ + 3Н₂.

Выход АТФ составляет 2,5 молекулы на 1 молекулу глюкозы.

В бактериях рода Aerobacter и Serratia часть образующегося пирувата конденсируется в ацетолактон. Ацетолактон может пойти на синтез валина или декарбоксилироваться в ацетоин. Ацетоин за счет НАДН₂ восстанавливается в 2,3-бутандиол. Это используется для промышленного получения бутандиола, который затем может быть неферментативным путем дегидрирован в бутадиен.

пируват ацетолактат ацетоин бутандион

Пируватдегидрогеназная реакция

Когда в клетках расщепление глюкозы протекает анаэробно, например по пути молочнокислого брожения, лактат содержит в себе около 93% той энергии, которая была заключена в исходной молекуле глюкозы. Молочная кислота – соединение почти такое же сложное, как глюкоза, к тому же реального окисления при гликолизе не происходит. Вся биологически доступная свободная энергия высвобождается из глюкозы или из другого органического топлива лишь в том случае, если все водородные атомы, связанные с атомами углерода данной молекулы, будут удалены и заменены кислородом с образованием СО₂. То есть наиболее энергетически выгодным процессом катаболизма глюкозы будет аэробное дыхание.

Чтобы вступить в цикл Кребса, пируват окисляется до ацетил-СоА и СО₂ реакцией окислительного декарбоксилирования при участии ферментов, объединенных структурно в так называемый пируватдегидрогеназный комплекс. Эта мультиферментная система, находящаяся у эукариотических клеток в митохондриях, а у прокариотических – в цитоплазме, катализирует следующую суммарную реакцию:

Пируват + НАД⁺ + СоА → Ацетол-СоА + НАДН₂ + СО₂.

В объединенном процессе дегидрирования и декарбоксилирования пирувата до ацетил-СоА участвуют последовательно три разных фермента:

- пируватдегидрогеназа (Е₁),

- дигидролипоилацетилтрансфераза (Е₂),

- дигидролипоилдегидрогеназа (Е₃),

а также пять коферментов:

- тиаминпирофосфат (ТПФ),

- флавинадениндинуклеотид (ФАД),

- кофермент А (СоА),

- никотинамидадениндинуклеотид (НАД⁺),

- липоевая кислота.

Липоевая кислота играет роль необходимого витамина, или фактора роста у некоторых микроорганизмов, тогда как высшие животные способны ее синтезировать из легко доступных предшественников. Активная форма липоевой кислоты представляет собой простетическую группу дигидролипоилацетилтрансферазы. Она присоединяется к полипептидной цепи фермента через остаток лизина посредством амидной связи. Липоидная кислота может существовать в окисленной (дисульфидной), восстановленной (дитиоловой) и ацетилированной формах. Поэтому липоильная группа действует и как переносчик водорода, и как переносчик ацетильных групп. Она переносит атомы водорода от пируватдегидрогеназы на дигидролипоилдегидрогеназу, а также ацетильную группу на кофермент А.

липоевая кислота дигидролипоевая кислота ацетиллипоевая кислота

Пируватдегидрогеназный комплекс из E.coli представляет собой частицу несколько большую по своим размерам, чем рибосома. В ядре комплекса находится дигидролипоилацетилтрансфераза. Ее молекула состоит из 24 субъединиц, в каждой из которых к двум специфическим остаткам лизина в активном центре присоединены две липоильные группы. К дигидролипоилацетилтрансферазе присоединены очень крупные молекулы пируватдегидрогеназы (содержит связанный тиаминпирофосфат) и дигидролипоилдегидрогеназы (содержит ФАД). К пируватдегидрогеназному комплексу присоединены еще два других фермента, регулирующие пируватдегидрогеназную реакцию: фосфатаза фосфопируватдегидрогеназы и киназа пируватдегидрогеназы.

Стадии окислительного декарбоксилирования пирувата:

При недостатке тиамина (витамина В₁) оказывается невозможным нормальное окисление пирувата. Особенно сильно страдает мозг, который получает всю необходимую энергию путем аэробного окисления глюкозы.

Процесс, катализируемый пируватдегидрогеназным комплексом в тканях животных необратим.

Регуляция образования ацетил-СоА регулируется при помощи ковалентной модификации пируватдегидрогеназного комплекса. Когда концентрация АТФ в митохондриях относительно высока и когда ацетил-СоА, а также промежуточные продукты цикла Кребса имеются в достаточном количестве, обеспечивающем удовлетворение энергетических нужд клетки, дальнейшее образование ацетил-СоА приостанавливается. АТФ активирует киназу пируватдегидрогеназы. Этот фермент фосфорилирует пируватдегидрогеназу по остаткам серина в активном центре молекулы. Обратную реакцию катализирует фосфатаза фосфопируватдегидрогеназы.

активная пируватдегидрогеназа

Pi (дефосфорилированная) АТФ

фосфатаза киназа

фосфопируват- Са²⁺ пируватде-

дегидрогеназы Mg²⁺ НАДН₂ гидрогеназы

Н₂О АДФ

неактивная пируватдегидрогеназа

(фосфорилированная)

Цикл Кребса (цикл лимонной кислоты, цикл трикарбоновых кислот)

Общая схема цикла Кребса – цифрами указано число атомов углерода в соответствующих промежуточных продуктах:

Пируват 3

СО₂

Ацетил-СоА 2

Оксалоацетат 4 Цитрат 6

Малат 4 Изоцитрат 6

СО₂

Фумарат 4 альфа-кетоглутарат 5

СО₂

Сукцинат 4 Сукцинил-СоА 4

Последовательность реакций цикла лимонной кислоты:

Первая реакция цикла Кребса – это необратимая реакция конденсации ацетил-СоА с оксалоацетатом, катализируемая цитратсинтазой, в результате образуется цитрат:

Высвободившийся СоА может образовывать новую молекулу ацетил-СоА. Цитратсинтаза является регуляторным ферментом и эта реакция лимитирует общую скорость цикла лимонной кислоты.

Вторая реакция – изомеризация цитрата в изоцитрат, катализируемая аконитазой, реакция идет через промежуточный продукт цис-аконитат:

Аконитаза – довольно сложный фермент, он содержит железо и кислотолабильные атомы серы, сгруппированные в так называемый железосерный центр.

Третья реакция – необратимое окислительное декарбоксилирование изоцитрата до α-кетоглутарата через промежуточный продукт оксалосукцинат, катализируется ферментом изоцитратдегидрогеназой. Это первая реакция, в которой восстанавливается НАД⁺:

В четвертой реакции происходит окислительное декарбоксилирование α-кетоглутарата до макроэргического соединения сукцинил-СоА с помощью α-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса:

Эта реакция практически идентична пируватдегидрогеназной реакции. И по структуре, и по функциям α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс очень напоминает пируватдегидрогеназный. Он состоит из трех ферментов и тех же пяти коферментов, но не включает регуляторные ферменты.

Пятая реакция является единственной в цикле реакцией субстратного фосфорилирования, катализируется ферментом сукцинил-СоА-синтетазой. В этой реакции сукцинил-СоА при участии ГДФ и неорганического фосфата превращается в сукцинат. Одновременно с этим происходит образование ГТФ за счет макроэргической тиоэфирной связи сукцинил-СоА. ГТФ может затем передавать свою концевую фосфатную группу на АДФ с образованием АТФ. Эта реакция катализируется ферментом нуклеозиддифосфаткиназой:

ГТФ + АДФ ↔ ГДФ + АТФ.

В шестой реакции происходит дегидрирование сукцината до фумарата. Она катализируется сукцинатдегидрогеназой, имеющей коферментом ФАД:

Сукцинатдегидрогеназа содержит один остаток ковалентно связанного ФАД и два железосерных центра. Малонат НООС-СН₂-СООН является конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы благодаря сходству структуры малоната с сукцинатом.

В седьмой реакции осуществляется гидратация фумарата до L-малата с помощью стереоспецифичного фермента фумаразы. Фумаратгидратаза (фумараза) высокоспецифична, она гидратирует толь транс-форму двойной связи фумарата и не действует на его цис-форму:

В восьмой, заключительной, реакции происходит регенерация оксалоацетата. Под действием НАД⁺-зависимой малатдегидрогеназы L-малат дегидрируется и превращается в оксалоацетат:

Равновесие этой реакции сильно сдвинуто влево, но в клетках реакция идет слева направо, потому что продукт этой реакции оксалоацетат быстро удаляется.

Суммарное уравнение цикла лимонной кислоты можно представить в следующем виде:

Ацетил-СоА + 3НАД⁺ + ФАД + ГДФ + Н₃РО₄ + Н₂О → 2СО₂ + 3НАДН₂ + ФАДН₂ + ГТФ + СоА.

В целом, от четырех промежуточных продуктов цикла Кребса в ферментативных реакциях дегидрирования отделяются 4 пары атомов водорода. Из них 3 пары используются на восстановление 3 пар НАД⁺ в НАДН₂, а одна для восстановления ФАД сукцинатдегидрогеназы в ФАДН₂. Два атома углерода, появляющиеся в виде СО₂, это не те атомы, которые вступили в цикл в виде ацетильной группы. В качестве дополнительного продукта образуется одна молекула АТФ.

В чем смысл цикла лимонной кислоты? Метильная группа уксусной кислоты очень устойчива к химическому окислению. Для прямого окисления ацетата до двух молекул СО₂ необходимы очень жесткие условия, совершенно несопоставимые с теми, какие существуют в клетках. Живые клетки в процессе эволюции научились использовать хотя и обходной, но зато более легкий путь, для которого не требуется столь высокой свободной энергии активации. Клетки научились присоединять ацетат к другому соединению и получать продукт, который гораздо легче, чем ацетат, поддается дегидрированию и декарбоксилированию. И хотя реакции цикла Кребса кажутся нам гораздо более сложными, чем это необходимо, тем не менее в них заключается наиболее легкий в химическом смысле путь, обеспечивающий данное превращение.

Регуляция скорости цикла лимонной кислоты осуществляется на уровне цитратсинтазной реакции, ингибиторами ее являются избыток цитрата, НАДН₂, сукцинил-СоА, ацил-СоА, активатором является АДФ.

Глиоксилатный цикл

У растений и некоторых микроорганизмов (E.coli) ацетильные группы часто служат не только высокоэнергетическим топливом, но и источником метаболитов, из которых строятся углеродные скелеты углеводов. В таких клетках действуют два варианта цикла лимонной кислоты: 1) обычная последовательность реакций, 2) особая ее модификация глиоксилатный цикл.

Ацетил-СоА

СоА

Оксалоацетат Цитрат

Малат Изоцитрат

СоА Сукцинат

Глиоксилат

Ацетил-СоА + Н₂О

Изоцитрат с помощью фермента изоцитратлиазы расщепляется в глиоксилат и сукцинат, глиоксилат далее соединяется с молекулой ацетил-СоА под действием фермента малатсинтазы и образуется малат:

изоцитрат сукцинат глиоксилат малат

При каждом обороте глиоксилатного цикла в него вступают две молекулы ацетил-СоА и образуется одна молекула сукцината, который затем используется в процессах биосинтеза. Сукцинат может превратиться через фумарат и малат в оксалоацетат, из которого образуется фосфоенолпируват. Фосфоенолпируват используется в качестве предшественника глюкозы. У животных глиоксилатный цикл отсутствует, изоцитратлиазы и малатсинтазы в животных клетках нет. У растений ферменты глиоксилатного цикла находятся в особых цитоплазматических органеллах – глиоксисомах, а у прокариот – в цитоплазме.

Пентозофосфатный цикл (гексозомонофосфатный шунт)

1 – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, 2 – лактоназа, 3 – 6-фосфоглюконатдегидрогеназа, 4 – изомераза, 5 – эпимераза, 6 – транскетолаза, 7 –трансальдолаза, 8 – транскетолаза.

Наряду с гликолизом и циклом Кребса существуют другие, второстепенные пути катаболизма глюкозы, имеющие специальное назначение, в них вырабатываются особые продукты, в которых нуждается клетка. Одним из таковых является пентозофосфатный путь, который поставляет два специальных продукта: НАДФН₂ и рибозо-5-фосфат.

Если клетке необходимы рибозы для синтеза нуклеиновых кислот, то пентозофосфатный цикл заканчивается на стадии образования рибозо-5-фосфата, тогда его суммарное уравнение можно записать:

Глюкозо-6-фосфат + 2НАДФ⁺ + Н₂О → Рибозо-5-фосфат + СО₂ + 2НАДФН₂.

Если клетке необходим НАДФН₂ в качестве восстановительных эквивалентов для процессов биосинтеза, например жирных кислот, то процесс протекает полностью и его суммарное уравнение будет иметь вид:

3Глюкозо-6-фосфат + 6НАДФ⁺ + 3Н₂О → 2-фруктозо-6-фосфат + 3СО₂ + 6НАДФН₂ + Глицеральдегид-3-фосфат.

Из двух молекул глицеральдегид-3-фосфата через обратные реакции гликолиза может синтезироваться еще одна молекула фруктозо-6-фосфата. Фруктозо-6-фосфат посредством фосфоглюкоизомеразы может опять превратиться в глюкозо-6-фосфат и, если еще нужен НАДФН₂, войти в пентозофосфатный цикл. В целом можно сказать, что если в цикл входят шесть молекул глюкозо-6-фосфата, то при полном обороте цикла регенерируется пять молекул глюкозо-6-фосфата, а шестая молекула полностью распадается до шести молекул углекислого газа и 12НАДФН₂.

Окислительное фосфорилирование

Все ферментативные этапы окисления углеводов, жиров и аминокислот сходятся в аэробных клетках к этой конечной стадии клеточного дыхания, на которой электроны переходят от органических субстратов к кислороду, а энергия, выделяемая при этом, используется для образования АТФ из АДФ и фосфата.

Общий механизм переноса электронов: в каждом обороте цикла лимонной кислоты специфичные дегидрогеназы отщепляют от изоцитрата, α-кетоглутарата, сукцината и малата четыре пары атомов водорода. Эти атомы водорода в определенной точке отдают свои электроны в цепь переноса электронов и превращаются таким образом в ионы Н⁺, которые поступают в водную среду. Электроны, переходя от одного переносчика к другому, достигают в конце концов цитохрома аа₃, или цитохромоксидазы, при участии которой они и передаются на кислород – конечный акцептор электронов у аэробных организмов. Всякий раз, когда атом кислорода присоединяет два электрона, поступающие к нему по цепи переноса, из водной среды поглощаются два протона, равноценные тем, в которые превратились два атома водорода, отщепленные ранее дегидрогеназами, в результате этого образуется молекула воды.

Помимо четырех пар атомов водорода, поставляемых циклом Кребса, образуются и другие атомы водорода, отщепляемые дегидрогеназами от пирувата, жирных кислот и аминокислот во время расщепления этих соединений до ацетил-СоА и других продуктов. Почти все эти атомы в конце концов передают свои электроны в дыхательную цепь, то есть на общий для всех аэробных клеток электронотранспортный путь.

Дыхательная цепь состоит из ряда белков с прочно присоединенными простетическими группами, обладающими способностью присоединять и отдавать электроны. Эти белки располагаются в определенной последовательности, в которой каждый из них способен присоединять электроны от предыдущего и передавать их тому, который следует за ним. Все белки, играющие роль переносчиков электронов, нерастворимы в воде и все они встроены во внутреннюю мембрану митохондрий. Электроны, поступающие в эту цепь переносчиков, богаты энергией, но по мере их продвижения по цепи, от одного переносчика к другому, они теряют свободную энергию. Значительная часть этой энергии запасается в форме АТФ с помощью молекулярных механизмов, действующих во внутренней мембране митохондрий. Перенос электронов сопряжен с синтезом АТФ из АДФ и фосфата: на каждую пару электронов, переданных по дыхательной цепи от НАДН₂ к кислороду, синтезируется три молекулы АТФ. Три участка дыхательной цепи, в которых энергия высвобождается в процессе окисления-восстановления и запасается в форме АТФ, называются пунктами фосфорилирования или пунктами запасания энергии:

I участок – НАД⁺/НАДН₂ (НАД-зависимые дегидрогеназы),

ФМН/ФМНН₂ (флавинзависимые дегидрогеназы),

[Fe-S₁, Fe-S₂, Fe-S₃, Fe-S₄, Fe-S₅] комплекс железо-серных белков,

СоQ/CoQH₂ (кофермент Q, или убихинон),

II участок – b₅₆₂, b₅₆₆, Fe-S, c₁, c,

III участок – аа₃ (цитохромоксидаза).

До убихинона включительно протоны и электроны передаются вместе, на II и III участке фосфорилирования происходит только перенос электронов цитохромами. Цитохромы при этом меняют степень окисления Fe³⁺/Fe²⁺. Последний из цитохромов – цитохромоксидаза аа₃– содержит две молекулы гемма и два атома меди, которая изменяет степень окисления Cu²⁺/Cu⁺. На этом этапе все четыре электрона передаются кислороду одновременно и вместе с четырьмя протонами из водной среды.

При восстановлении О₂ образуется сильный основной анион О^2-, который связывает из среды два протона и переходит в воду. Поток электронов сопряжен с выкачиванием протонов в межмембранное пространство и образованием протонного градиента и сопровождается образованием АТФ. Согласно гипотезе Митчела, фактором, сопрягающим окисление с фосфорилированием, является электрохимический, протонный потенциал, возникающий на внутренней мембране митохондрий в процессе транспорта электронов.

Процесс фосфорилирования катализируется Н⁺-АТФ-азой. Этот сложный комплекс состоит из растворимого каталитического компонента F₁ и мембранного компонента F₀. Компонент F₀ является ионным каналом для протонов и связывает компонент F₁ с мембраной. Перенос протонов по градиенту F₀ субъединицей происходит при прохождении электронами тех участков дыхательной цепи, где соседние компоненты резко отличаются значениями окислительно-восстановительных потенциалов и падения свободной энергии достаточно для синтеза F₁ субъединицей одной макроэргической связи АТФ. Если первичной дегидрогеназой, передающей электроны в дыхательную цепь, является НАДН, то синтезируется 3 молекулы АТФ, если первичной дегидрогеназой является ФАДН₂ сукцинатдегидрогеназы, то первый участок сопряжения пропускается и синтезируется 2 молекулы АТФ (пара электронов, отщепляемая от сукцината, поступает в дыхательную цепь на уровне убихинона, минуя первый участок.

Благодаря тому, что дыхательная цепь состоит из такого большого числа электронов, довольно большое снижение свободной энергии, которым сопровождается перенос одной пары электронов от НАДН₂ к кислороду разбивается на ряд относительно небольших порций, соответствующих отдельным этапам переноса. На трех этих этапах количество выделяющейся свободной энергии приблизительно совпадает со свободной энергией образования АТФ. Дыхательная цепь представляет собой своего рода каскад, при помощи которого клетка получает свободную энергию, извлекаемую из клеточного топлива, в расфасованном, удобном для использования виде.

Таким образом, высокоэнергетические атомы водорода, образовавшиеся в цикле Кребса, проходят по дыхательной цепи, где вся их энергия запасается в виде синтеза молекул АТФ. Суммарное уравнение полного окисления глюкозы:

Глюкоза + 6О₂ → 6СО₂ + 6Н₂О

Баланс АТФ при полном окислении глюкозы составляет 2АТФ из гликолиза + 6АТФ из 2НАДН гликолиза + 6АТФ из 2НАДН окислительного декарбоксилирования пирувата + 18АТФ из 6НАДН цикла Кребса + 4АТФ из 2ФАДН₂ цикла Кребса + 2АТФ из 2ГТФ цикла Кребса = 38 молекул АТФ.