Методы исследования биомакромолекул

Предмет молекулярной биофизики

IV. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

Молекулярная биофизика изучает структуру и физические закономерности организации биомакромолекул, силы и связи, обеспечивающие их функции в биологических системах. К биомакромолекулам относят белки и нуклеиновые кислоты. Их молекулярная масса и размеры весьма вариабильны 1-1000 кD. Состоят биомакромолекулы из множества (десятки и сотни тысяч) соединенных ковалентными связями атомных групп. Такая сложность строения требует особых методов исследования.

1. Методы, связанные с оценкой подвижности макромолекул в растворе, что позволяет судить об их форме и молекулярной массе. Например, оценка поступательной и вращательной диффузии макромолекул. Первая используется для молекул преимущественно сферической формы, вторая – эллипсоидной.

Известно, что при движении молекул в растворе возникает сила трения:

F = f u, где

f – коэффициент внутреннего трения (фракционный коэффициент), u -скорость.

Для сферической макромолекулы эта сила будет равна (формула Стокса):

F=6 p h r, где

h – вязкость среды, r – радиус молекулы

Для определения величины f можно использовать коэффициент диффузии:

и тогда:

а так как масса молекулы равна:

,

то есть масса молекулы обратно пропорциональна коэффициенту диффузии в третьей степени.

Для макромолекул вытянутой формы используется коэффициент вращательной диффузии ; для оценки которого используют метод двойного лучепреломления в потоке.

Способ определения коэффициента диффузии лежит в основе методов:

Квазиупругое рассеяние света. Этот метод основан на свойстве рассеянного света изменять l.

Изменение l при движении молекул приводит к возникновению эффекта Доплера. Получается информация о динамических свойствах молекул (поступательная и вращательная диффузия, внутримолекулярное время релаксации).

При спонтанной диффузии молекул, обусловленной тепловым движением молекул, спектр рассеянного света подчиняется распределению Лоренца:

где:

I – интенсивность рассеянного света, w – круговая частота (2 p n) света,

N – число макромолекул в исследуемом объёме,

– фактор рассеяние,

D – коэффициент поступательной диффузии, j – угол рассеяния света,

a – молекулярная поляризуемость.

Полуширина спектра:

.

Измеряя полуширину как функцию sin²j/2, можно получить коэффициент диффузии D.

Сидементация молекул-осаждение веществ в жидкости под действием силы тяжести.

Допустим, в пробирке имеются молекулы с молекулярной массой 10⁵, высота столба жидкости 10^{-2 м, тогда:}

Следовательно, тепловая энергия в 200 раз больше энергии седиментации.

Для регистрации седиментации нужно увеличить уровень энергии на 4 – 5 порядков, что делают с помощью центрифуги. Обычно используют 350 000 g(60 – 70 тыс.об./мин).

– скорость седиментации.

Определяя положение шлирен – пик в различные моменты времени, вычисляют скорость седиментации.

На молекулу действуют силы относительно оси вращения ротора:

F_c – сила сопротивления,

F_в – сила выталкивания,

F_ц – центробежная сила.

Седиментация заканчивается, когда

где m – масса, w-объем, r – радиус молекулы, а Fс^-1, n – об/мин.

,

где m₀ (r₀) – масса (плотность) вытолкнутой жидкости

f – коэффициент внутреннего трения, u – скорость седиментации.

F_ц – F_в = F_с и выразим F_в через F_ц.- F_с:

или:

Введем:

где S – коэффициент седиментации (1 сведберг= 10^-3с).

Парциальный удельный объём:

для макромолекул это возрастание объёма растворителя при растворении 1 кг сухого вещества в фиксированном объёме растворителя.

– формула Сведберга.

Следовательно, нужно заранее определить D и `V и измерить на центрифуге S и получим ММ. Необходимо определить S и D в одинаковых растворителях, при одной температуре.

Электрофорез макромолекул – движение частиц в жидкой фазе под действием электрического поля.

F_э=q E,

где q – заряд молекулы, Е – напряжённость поля, F_э – действующая сила.

F_c=f u,

где f – коэффициент трения (для сферы 6phr), F_c – сила сопротивления,

u – скорость движения.

После установления стационарного состояния:

q E = f u при этом скорость движения постоянна (u = const.)

– электрофоретическая подвижность.

Для сферы:

Если исследуют белки (молекулярную массу), то электрофорез проводят в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) в полиакриламидном геле (Вебер, Осборн, 1969). Исследования проводят после обработки 1% раствором ДСН, который является детергентом, обладающим денатурирующим действием, и добавления b – меркаптоэтанола для разрыва дисульфидных связей. ДСН одинаково связывается со всеми белками (1,4 кг ДСН на 1 кг белка). Каждая молекула ДСН несёт один отрицательный заряд и ~ общая плотность зарядов для разных белков.

Таким образом, поверхностная «шуба» из молекул ДСН устраняет зарядовые значения между белками. После денатурации белок приобретает форму стержня Æ1,8 нм. Длина ~ молекулярной массе.

В качестве носителя используется полиакриламидный гель в концентрации 5 – 15%.

,

где а и в – константы, зависящие от свойств геля.

2. Термодинамические исследования

Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия. Измеряется количество теплоты, необходимое для повышения температуры объекта на заданную малую величину – DТ (то есть DН). Если в этот момент происходит «разворачивание» глобулы – DН в камере с белком много больше, чем DН в контрольной камере (буферный раствор) – этот контроль позволяет внести поправку на величину теплоёмкости.

Чувствительность микрокалориметрии – 16 10^-6 Дж/моль×град

Кривые представляют в виде температурной зависимости теплоёмкости С_р.

При переходе из нативного в денатурированное состояние максимальная С_р соответствует температуре плавления Т_п. Если в белке есть домены с разной термоустойчивостью, кривая имеет два пика.

3. Оптические (спектральные) методы

Рентгеноструктурный анализ.

Этот метод основан на явлении дифракции рентгеновских лучей.

Дифракция – огибание волной препятствия – происходит, когда l сравнима с размером объекта. Поэтому для исследования молекул используются рентгеновские лучи, l ~ размерам атома. Получая дифракционную решётку, можно по картине судить о структуре макромолекул.

Оптическое вращение и круговой дихроизм.

Оба метода основаны на пропускании через образец монохроматического поляризованного света.

Дисперсия оптического вращения (ДОВ) оценивается по углу поворота плоскости поляризации вышедшего света по сравнению с падающим. Основной вклад в неё вносят a – спирали белков и по величине дисперсии можно оценить содержание a – спиралей в белках (зависимость угла поворота a от l).

Круговой дихроизм (КД):

Его величина определяется в разнице поглощения образцом право – и лево – поляризованного света Разница объясняется различными коэффициентами молярной экстинции для право – и лево – поляризованного света и позволяет определить направление, в котором «закручена» спираль – зависит [Q]_l от l.

Для каждой хромофорной группы аминокислот, существует точка пика поглощения, преимущественно в УФ области (230 – 310 нм)

Простой абсорбционный спектр, таким образом, может позволить исследовать аминокислотный состав белка.

a – спираль

b – спираль

клубок

По структуре КД можно определить доли глобулярных и фибриллярных участков и неупорядоченных структур.

Флуоресцентная спектроскопия белков.

а) Собственная флуоресценция белков, имеющих в составе аминокислоты: Tyr, Try, Phe, и по спектру флуоресценции можно судить о положении этих остатков в белке, и взаимодействие его с окружающими группами.

l_ф чистого Try равна 323 нм, в его вариации в белках от 320 – 342 нм.

б) «Тушение флуоресценции» введёнными хромофорами (то есть миграция энергии с белка на ионы Cs⁺, J^-, акриламид) позволяет оценить доступность хромофорных групп для внешних реагентов.

в) Более удобным в ряде случаев оказывается двухволновой флуоресцентный метод, то есть регистрация одновременно и , что позволяет оценить динамику смещения спектра, так как положение максимальной флуоресценции более чувствительно к конформационным перестройкам

– двухволновой флуоресцентный параметр, он заметно уменьшается при разворачивании глобулы.

г) Флуоресцентная спектроскопия с временным (наносекундным) разрешением (флаш – фотолиз).

Флуоресценция возбуждается наносекундными вспышками лазера, и по повороту угла поляризации измеряется степень поворота хромофорной группы за указанное время. Метод позволяет регистрировать быстрые процессы.