Подготовка среды для культивирования продуцента и посевного материала (первая стадия).

ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРОИЗВОДСТВО БАВ ИЗ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ

В основе промышленного производства БАВ (лекарственный субстанций и др.) из культуры клеток растений лежит ряд последовательных стадий и операций: получение высокопродуктивных продуцентов, разработка оптимальных условий культивирования

продуцента БАВ с максимальным биосинтезом целевого продукта, разработка и внедрение в практику соответствующих методов и условий выделения и очистки БАВ, создание готовых препаратов и контроль качества.

Для каждого продуцента БАВ, для каждого вновь образуемого каллуса и суспензионной культуры растений разрабатывается своя оптимальная среда, которая должна отвечать следующим основным требованиям:

1) обеспечивать хороший рост биомассы и максимально возможное образование целевого продукта – алкалоидов, гликозидов, полисахаридов и др. продуктов вторичного синтеза;

2) содержать доступные по стоимости компоненты;

3) обеспечивать применение наиболее экономических и эффективных приемов выделения и очистки БАВ.

Среды Мурасиге-Скуча (МС) и Шенке-Хильдебрандта (ШХ) относятся к наиболее употребляемым в работе с культурами клеток растений и оказались эффективными для роста различных одно- и двудольных растений. Среди МС и ШХ содержат железо в хелатированной форме в комплексе с ЭДТА. Это обеспечивает его доступность при рН до 8,0 в течение всего периода роста культуры, тогда как при отсутствии хелатирующего

агента недостаток железа может проявиться очень быстро.

В промышленных условиях стерилизация питательных сред осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным. Периодический метод стерилизации применяют при использовании небольших объемов среды. Он заключается в том, что среда, нагретая до определенной температуры (120-125°С) непосредственно в ферментаторах или в специальных паровых стерилизаторах ГПСД-1700, выдерживается при этой температуре в течение 30-60 мин (в заивисимости от объема среды или от её состава, после чего охлаждается до 27-30°С). Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонну, через которую пропускается острый пар (давление пара около 5 атм.). Пар подается сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему пар поступает в среду и быстро её нагревает. Среда в колонну подается снизу и

движется по спирали вокруг внутренней трубы. Нагретая в колонне до необходимой для стерилизации температуры (около 125°С), среда поступает в специальный аппарат –

выдерживатель, где она выдерживается при температуре 120-125°С. время выдерживания зависит от состава среды и составляет 5-10 мин. Из выдерживателя стерильная среда поступает в змеевиковый холодильник.здесь она охлаждается до 30-35°С (на выходе)

и поступает в ферментатор. Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ перед периодическим методом: возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности

среды.

Подготовка посевного материала – одна из ответственных операций в цикле биологического методы получения БАВ из культуры тканей. Культуру ткани (коллекцию культуры) заводы получают из академий и университетов. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, физиологии, характеристики среды для культивирования и хранения.

Для твердофазного метода культуру ткани выращивают на агаризованной стерильной питательной среде в колбах вместимостью 0,25 л в термостатируемом помещении или термостате с температурой 27±1°С. на 38-46 сут. роста.

Для глубинного (суспензионного) метода культуру ткани предварительно выращивают на агаризованной стерильной среде в пробирках, затем из пробирок высеивают в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации глубинного выращивания на качалках в течение 38-46 сут. для каждой генерации. Из второй генерации культуры (в колбе) делают посев в небольшой (10 л) инокулятор, а затем хорошо развивающуюся культуру пере-носят в основной ферментатор. Для посева в основном ферментаторе используют от 5 до 10 объемных процессов посевного материала (инокулята).