Физико-химические механизмы реализации кислородного эффекта.

Патогенез воздействия ионизирующего излучения на организм человека. Механизмы пострадиационного восстановления. Радиочувствительность. Действие на эмбрион и плод. Стохастические последствия. Радиационный канцерогенез, генетические дефекты.

Первичные физико-химические процессы в молекулах после поглощения энергии ионизирующего излучения.

Первичные физические процессы после облучения длятся от 10^‑16 до 10^‑11 с, сопровождаются поглощением биологическими тканями энергии излучения и ионизацией или возбуждением атомов и молекул. Ионизация представляет собой отрыв электрона от атома с образованием положительно заряженного иона. Возбуждение представляет собой переход электрона на более удаленную от ядра орбиталь, если энергии излучения недостаточно для его отрыва.

Существуют прямо и косвенно ионизирующие излучения. К прямо ионизирующим относятся заряженные частицы (альфа- и бета-, протоны), которые производят ионизацию за счет непосредственного кулоновского взаимодействия с электронами атомов. К косвенно ионизирующим излучениям относятся электрически нейтральные излучения ‑ рентгеновское, гамма-, нейтронное.

Ионизирующая способность характеризуется линейной плотностью ионизацииили удельной ионизацией ‑ числом пар ионов на микрометр пробега, и линейной передачей энергии (ЛПЭ) ‑ средней энергией, теряемой на единицу длины пробега в ткани или веществе и измеряемой в кэВ/мкм. ЛПЭ возрастает при снижении скорости и энергии излучения и максимальна в конце пробега. На конце пробега протонов и α-частиц характерен резкий подскок отдаваемой энергии в виде пика Брегга, и возрастает плотность ионизации.

ИИ подразделяется на редко и плотно ионизирующее. Границей между ними условно принята величина ЛПЭ = 10 кэВ/мкм. Бета-, гамма-, рентгеновское излучения являются редко ионизирующими(ЛПЭ<10 кэВ/мкм). Альфа-, протонное и нейтронное излучения относятся к плотно ионизирующим (ЛПЭ>10 кэВ/мкм).

Для сравнения биологического действия различных видов ИИ, имеющих различную величину ЛПЭ существует понятие относительная биологическая эффективность (ОБЭ). ОБЭ излучения представляет собой относительную способность по сравнению с рентгеновским излучением вызывать лучевое поражение определенной выраженности при равной поглощенной дозе. Количественной оценкой ОБЭ излучения служит коэффициент (К_ОБЭ), который представляет собой отношение дозы стандартного (рентгеновского с энергией 100-250 кэВ) излучения, вызывающего определенный биологический эффект к поглощенной дозе любого вида ИИ, вызывающего такой же эффект.

ОБЭ увеличивается при возрастании ЛПЭ до 100-120 кэВ, а при дальнейшем его повышении быстро снижается. Это связано с тем, что при высокой ЛПЭ избыток энергии расходуется вхолостую, не достигая критических для жизнедеятельности структур клетки. Величина ОБЭ может быть разной по различным критериям оценки лучевого поражения и условиям воздействия ИИ. На величину коэффициента ОБЭ влияет величина дозы и мощность дозы, кратность облучения. Коэффициент ОБЭ нейтронов с энергией 1 МэВ по лучевому поражению костного мозга человека равен 1,5-2,5, кишечника и кожи – 3,5-4,5.

Физико-химическая стадияразвивается в результате взаимодействия образовавшихся ионов и свободных электронов между собой и окружающими атомами и молекулами. Завершается образованием новых ионов, сольватированных (гидратированных) электронов, возбужденных молекул, химически активных свободных радикалов. Эта цепь радиационно-химических превращений, приводящая в итоге к образованию свободных радикалов, получила название радиолиз.

Свободные радикалы представляют собой электрически нейтральные атомы и молекулы с неспаренным электроном на внешней орбитали. Неспаренные электроны свободных радикалов реакционно способны, так как должны спариться с электроном другого радикала или удалиться из атома. Время существования свободных радикалов ограничено их высокой реакционной способностью, но существенно превышает срок существования ионов, возникших при поглощении энергии ИИ, поэтому биологический эффект радиации связан, в основном, с действием свободных радикалов. Радиус их действия ограничен 3,0-3,5 нм. Свободные радикалы, отдающие электроны, выступают в роли восстановителя и, принимающие электроны, в роли окислителя.

Ионизирующее излучение может оказывать прямое или непосредственное повреждающее действие на макромолекулы и косвенное повреждающее действие, когда макромолекулы повреждаются другими молекулами, получившими энергию ИИ.

Радиолиз воды.Так как ткани живых организмов на 70% и более состоят из воды, значительная часть энергии ионизирующих излучений поглощается молекулами воды и запускает каскад процессов, которые получили название радиолиз воды. Продукты радиолиза воды и опосредуют повреждающее действие ИИ на биологически значимые молекулы. Радиочувствительность молекул характеризуется степенью выраженности их радиолиза, оцениваемой по радиационно-химическому выходу (G), соответствующему числу изменившихся или вновь образовавшихся молекул на 100 эВ поглощенной энергии излучения, что близко к величине их концентрации в микромолях (мкМ) при облучении в дозе 10 Гр.

- Если под действием ИИ из молекулы воды выбивается электрон, образуется положительно заряженная молекула воды (Н₂О + hν = Н₂О⁺ + е^‑).

- Если энергии недостаточно для ионизации, образуется возбужденная молекула воды (Н₂О + hν = Н₂О*).

- Электрон, освободившийся при ионизации воды, может быть захвачен с образованием отрицательной молекулы воды (е^‑ +Н₂О= Н₂О^‑) или окружить себя четырьмя молекулами воды с образованием гидратированного электрона (е^‑_aq).

Перечисленные первичные продукты взаимодействия ИИ с водой нестабильны и гидролизуются с образованием ионов и свободных радикалов:

- Н₂О⁺ → ОН^• + Н⁺

- Н₂О* → Н^• + ОН^•

- Н₂О^– → Н^• +ОН^–

Образовавшиеся из воды радикалы и электроны могут вступать во взаимодействие между собой и другими молекулами воды с образованием перекиси водорода, молекулярного водорода и новых радикалов. При взаимодействии с молекулами растворенного кислорода образуются перекисные радикалы, с молекулами органических веществ – органические радикалы. При взаимодействии с хинонами и убихинонами образуются радиотоксины.

- ОН^• + ОН^•= Н₂О₂ (пероксид водорода).

- Н^• + О₂→ НО₂^•(гидропероксидный радикал).

- О₂ +е^-_aq→ О₂^-•(супероксиданион-радикал).

- RH + ОН^• → Н₂О + R^•(органический радикал).

- RH + Н^• → H₂ + R^•(органический радикал).

- RNH₂ + Н^• → NH₃ + R^•(при наличии аминогруппы происходит дезаминирование и образование органического радикала).

Эндогенный оксид азота (NO^•), основной локальный регулятор тонуса артериальных сосудов, сам является радикалом и активно взаимодействует с супероксиданион-радикалом с образованием пероксинитританиона:

О₂^-•+NO^•→ ONOO^•

Пероксинитританион является токсичным веществом, при распаде образует высокореактивные продукты – гидроксильный радикал ОН^•, диоксид азота NO₂^•,нитроний ион NO²⁺.

Из числа возникших при радиолизе воды радикалов к окислителям относятся гидроксильный, гидропероксидный исупероксиданион- радикалы, перекись водорода. Гидроксильный радикал (ОН^•) является самым сильным окислителем, образующимся при радиолизе воды, пероксид водорода – слабый окислитель. К сильным восстановителям относятся водородный радикал и гидратированный электрон.

В присутствии кислорода возникают дополнительные радикалы, которые усиливают повреждающее действие ИИ и делают повреждения трудно доступными для репарации. Это явление получило в радиобиологии название кислородный эффект (КЭ). В атмосфере кислорода выход повреждений макромолекул в 3 раза больше, чем в атмосфере азота.

Радиолиз нуклеиновых кислот. Под действием ИИ происходит выбивание электронов, перемещение дефектного участка по полинуклеотидной цепи с образованием свободных радикалов в области остатков тимина или цитозина, пуриновых колец, фосфатно-углеводных связей. Большая часть энергии ионизации расходуется на разрушение структуры оснований ДНК, остальная часть (10-20%) ведет к разрыву фосфатно-углеводных связей. Из-за лабилизации связей между ДНК и гистонами происходит деконденсация хроматина, что изменяет доступность поврежденных участков ДНК как к действию агентов фиксирующих повреждение, так и репарационных ферментов. Однако процессы нуклеазной деградации превалируют над процессами ресинтеза.

В результате непосредственного образования радикалов или под действием продуктов радиолиза воды (гидроксильный радикал) в ДНК наблюдаются одно- и двунитевые разрывы, сшивки ДНК–ДНК, ДНК–РНК, ДНК–белок, внутримолекулярные сшивки, модификация азотистых оснований, образование тиминовых димеров. Радикалы ОН^•способныотщеплятьатомы водорода у всех атомов углерода дезоксирибозы ДНК, и образование радикалов у С₃ и С₅ ведет к расщеплению фосфорноэфирных связей. Определено, что облучение в дозе 1 Гр вызывает образование в клетках от 10 до 100 двунитевых разрывов, 1000 одиночных разрывов и повреждение около 5000 азотистых оснований.

Среднее время реализации структурных повреждений хромосом составляет 20 минут. Повреждения в хромосомах сразу после облучения нестабильны, происходит взаимодействие с соседними молекулами с последующей стабилизацией и репарацией (к 6 ч). Большинство однонитевых разрывов быстро репарируется. Около 10% двунитевых разрывов не подвергается репарации, что вызывает образование хромосомных аберраций. Радиочувствительность клеток различается на разных стадиях клеточного цикла. К действию радиации клетки наиболее чувствительны в фазе митоза, когда практически отсутствуют процессы ферментативной репарации ДНК.

Радиационное повреждение хромосом требует более, чем одного акта ионизации. Энергия для разрыва при прямом эффекте составляет 100 эВ. Под действием ИИ образуются следующие виды хромосомных аберраций: концевые делеции и фрагментация хромосом, образование кольцевых хромосом после отрыва фрагментов и соединения концов делеций, транслокации вследствие внутрихромосомных и симметричных межхромосомных обменов, образование дицентриков вследствие ассметричного обмена между двумя хромосомами и хромосомных мостов. Хромосомные аберрации сопровождаются потерей генетического материала (в виде ацентрических фрагментов), неравномерным разделением хромосом, механическими препятствиями к делению клетки (мосты).

Радиолиз белков. При прямом действии ИИ из молекулы белка выбиваются электроны с образованием положительных ионов. В результате в полипептидной цепи начинается миграция электронов для заполнения дефектных участков, и возникают свободные радикалы. Свободные радикалы белковых молекул образуются также при взаимодействии с продуктами радиолиза воды. Под воздействием свободных радикалов в присутствии кислорода происходит модификация аминокислот в полипептидной цепи, разрыв слабых (водородных, гидрофобных) и сильных (дисульфидных, пептидных) связей, отщепление аммиака, сероводорода, образование новых ковалентных связей, что ведет к возникновению сшивок и агрегатов и нарушению в итоге нативной структуры белка. Радиационно-химические изменения конформационной структуры белков, прежде всего вторичной и третичной их структуры, влекут за собой нарушения их биологических свойств, в том числе ферментативной активности.

Радиолиз липидов.Фосфолипиды, составляющие структурную основу клеточных мембран, считаются наиболее радиочувствительными из органических веществ. Под воздействием поглощенной энергии ионизирующего излучения легко образуются радикалы ненасыщенных жирных кислот, которые после взаимодействия с кислородом образуют гидропероксиды и новые свободные радикалы, что поддерживает цепной характер окисления липидов. В присутствии ионов с переходной валентностью происходит разветвление цепных реакций.

Радиация активирует цепные реакции, которые в обычных условиях протекают в клетке с очень малой скоростью и контролируются эндогенными ингибиторами. В перекисном окислении липидов (ПОЛ) выделяют стадии инициации (1), продолжения реакции (2), разветвления цепей (3), и в присутствии ингибиторов возможна стадия обрыва цепей (4).

1.RH + hn ®R^•+H^•,

О₂^-•+RH ®R^•+HO₂^•,

OH^• + RH ®R^•+H₂O

2. R^• + O₂ ® ROО^•,

ROО^• + RH ®ROOH + R^•

3. ROOH + Fe²⁺ ®RO^•+ Fe³⁺ + OH^–,

RO^• + RH ® ROH +R^•,

R^• + O₂ ®ROО^•

4. R^• + R^• ®R–R,

ROО^• + R^• ®ROOR^•,

ROО^• + ROО^• ®ROOR^•+ O₂,

ROOR^• + InH(Ингибитор)® ROOH+ RH + In,

ROOH + GSH(Глутатион)®ROH +H₂O + GS–SG

Образование радикалов фосфолипидов ведет к разрыву молекулы по месту эфирной связи с образованием лизоформ. Перекисные продукты способны оказывать токсический эффект на мембраны, изменять химический состав липидов, их вязкость, проницаемость, электрокинетический потенциал, рецепцию. В итоге нарушаются жизненно-необходимые функции мембран как суперструктуры: барьерная, рецепторно-сигнальная, регуляторно-ферментативная, транспортная, что может вести клетку к гибели. Нарушаются проницаемость мембран и транспорт через них ионов, активация мембраносвязанных ферментов, снижается продукция макроэргов, что снижает активность репарации ДНК.

Нарушение энергетического обмена происходит в результате повреждения мембран митохондрий, выравнивания концентраций натрия и калия в клетке из-за нарушения наружной мембраны клетки. Дисбаланс между активностью нуклеаз и полимераз ведет усилению катаболизма и деградации хроматина. При пострадиационном апоптозе клеток фрагментация ДНК сопровождается распадом ядерной и других мембран.

ПОЛ в определенных пределах происходит и без воздействия радиации в мембранах митохондрий, микросом, лизосом, эндоплазматического ретикулума. Регуляция ПОЛ осуществляется при участии супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, свободных тиолов, веществ, обрывающих цепные процессы (a-токоферол, убихинон, ретинол, b-каротин, некоторые стероидные гормоны). Фосфолипаза А₂ обеспечивает удаление наиболее поврежденных фрагментов ненасыщенных жирных кислот и их перенос из гидрофобных участков биологических мембран в гидрофильные, где они инактивируются.

Радиолиз углеводов. ИИ вызывает образование из углеводов свободных радикалов и перекисей, из глицеринового альдегида метилглиоксаля, который ингибирует синтез ДНК, белка и деление клеток.

Сущность кислородного эффекта заключается в усилении радиационного повреждения биологических макромолекул в присутствии кислорода и ионов переходной валентности (Fe⁺², Cu⁺, Zn²⁺). В результате первичного радиолиза воды образуется равное количество положительно и отрицательно заряженных ионов, которые выступают в роли окислителей или восстановителей, соответственно. Равновесие между окислителями и восстановителями резко изменяется в присутствии кислорода. Восстановительные радикалы е^–и Н^• после взаимодействия с кислородом образуют окислители: О₂^-•и НО₂^•. В результате последующих физико-химических реакций образуются другие активные формы кислорода: атомарный кислород и синглетный кислород – О₂^΄ (долгоживущая возбужденная форма кислорода). Синглетный кислород образуется при участии О₂^-•:

О₂^-• + ОН^• + Н⁺ →О₂^΄ +Н₂О

О₂^-• + Н₂О₂ →О₂^΄ +2ОН^•

Супероксиданион-радикал (О₂^-•) химически менее реактивен, чем гидроксильный радикал (ОН^•) и молекулярный кислород в синглетной форме (О₂^΄). Пероксид водорода (Н₂О₂) – умеренный окислитель, химически менее реактивен, чем О₂^-•, и по этой причине дольше существует в растворах, хорошо проходит через клеточные мембраны, в клетках метаболизируется до воды двумя антиокислительными ферментами: каталазой и глутатионпероксидазой. Гидропероксидный радикал (НО₂^•) – слабая кислота, в нейтральной среде диссоциирует до О₂^-•и при восстановлении переходит в Н₂О₂:

НО₂^• → Н⁺ + О₂^-•

НО₂^• + НО₂^• → Н₂О₂ + 2О

При радиолизе органических веществ их радикалы становятся способными к взаимодействию с молекулярным кислородом. Повреждение макромолекулы завершается образованием ее пероксидного радикала:

R^• + О₂ →RОО^•

В присутствии кислорода в ДНК образуются пероксиды азотистых оснований, происходит разрыв N-гликозидной связи пуриновых оснований, разрыв пуринового и пиримидинового кольца, в целом увеличивается число повреждений оснований ДНК в 3 раза. Образование пероксидных радикалов дезоксирибозы ведет к разрыву углеводнофосфатной цепочки. Под действием кислорода число однонитевых и двойных разрывов ДНК может увеличиться в 2-2,5 раза.