Объяснение преподавателя.
Методика проведения занятия и методические указания по теме.
Тема 12. Использование в вирусологии культур клеток. Заражение культур клеток. Индикация вируса
Задание к следующему занятию.
Подведение итогов занятия.
Контрольные вопросы:
1. Методика получения первично трипсинизированных культур клеток по методу Дюльбекко и Фогт.
2. Сущность трипсинизации, техника проведения.
3. Для чего посуду закрывают резиновыми пробками.
.
Цель занятия: ознакомление с методикой заражения клеточных культур вируса. Изучение методов индикации вирусов в культурах клеток.
Оборудование и материалы: микроскопы, культуры клеток с предыдущего занятия, фиксированные культуры клеток, фотографии, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.
12.1 Подбор культур клеток. Не всякая клетка чувствительна к любому вирусу. Вирус к первичной культуре обычно успешно адаптируется при условии, если культура получена из органов животного, естественно восприимчивого к данному вирусу. Однако адаптация вируса к перевиваемым клеткам более сложна, а в ряде случаев неосуществима. Для культивирования некоторых вирусов до сих пор неизвестно ни одной клеточной системы. Для культивирования вируса используют обычно молодые клетки, т. е. в первый день формирования монослоя, а в некоторых случаях (для парвовирусов свиней) клетки заражают при их посеве, так как вирус интенсивно размножается при наличии делящихся клеток (когда они находятся в стадии логарифмического роста).
12.2 Заражение клеток. Для этого отбирают пробирки (или матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1–2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1–0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. В таком виде пробирки (матрасы) оставляют от 1 до 2 ч при 22 или 37 °С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вируссодержащий материал удаляют из пробирок (матрасов) и наливают поддерживающую среду (в пробирку 1–2 мл, в матрасы около 10 % его объема). При выделении вируса из патологического материала некоторые пробы (фекалий и др.) могут оказывать токсическое действие на клетки, поэтому после адсорбции вируса монослой клеток отмывают 1–2 раза раствором Хенкса (или питательной средой) и затем наливают поддерживающую среду.
Все пробирки выдерживают монослоем вниз 1-2 часа при комнатной температуре (для адсорбции вирусов на клетках).
12.3 Культивирование вируса. Пробирки (матрасы) закрывают герметически резиновыми пробками и ставят на инкубацию в термостат при 37 °С. Наиболее широко применяют стационарное инкубирование. При этом матрасы кладут в горизонтальном положении, пробирки – под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий зараженные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе – роллерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.
На следующий день заменяют питательную среду. При необходимости ставят контроль на токсичность вируссодержащей суспензии.
Для каждой пробы материала обычно используют не менее 4–10 пробирок с культурой клеток. Для контроля оставляют 4–6 пробирок с незараженной культурой клеток, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую.
В культурах клеток, зараженных вирусом, питательную среду можно не менять в течение 7 дней, а рН среды (6,9–7,4) поддерживать с помощью 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия. При более длительном культивировании инфицированных клеток (аденовирусы и др.) среду меняют.
Все пробирки (матрасы) после заражения клеток ежедневно исследуют под малым увеличением микроскопа, сравнивая культуры клеток, зараженные вирусом, с контрольными.
В термостате адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают внутрь их и начинается их репродукция. Новые вирусные частицы покидают (полностью или частично) клетки, в которых они образовались, проникают в непораженные клетки, репродуцируются в них, переходят в новые клетки и поражают их. Так продолжается до тех пор, пока есть живые неповрежденные клетки. В результате этого процесса практически все клетки в матрасе или пробирке поражаются вирусом, хотя абсолютно все почти никогда не поражаются.
Вирус накапливается в основном в культуральном жидкости, но часть вирионов может оставаться и внутри не разрушенных вирусом клеток. Чтобы оставшийся в клетках вирус освободить, клетки тщательно разрушают или многократным замораживанием – оттаиванием (2–3 раза), или с помощью ультразвука.
12.4 Индикация (обнаружение) вируса в культуре клеток. Существуют следующие основные методы индикации вируса в культуре клеток: по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию (ЦПЭ, ЦПД); по положительной реакции гемадсорбции (РГАд); по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции (РИФ); по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией и др.
ЦПД. Наиболее широко и часто о размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию. ЦПД называются любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Физиологические изменения клеток установить довольно сложно, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, используя малое увеличение (объектив х8–10, окуляр х7–10), осмотреть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с такими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп отличия зараженной культуры клеток от контрольной можно считать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь монослой или отмечаться только в виде небольших очажков измененных клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если изменению (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в пробирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если 3/4– на три, если 1/2– на два креста, 1/4– на один крест. Но эти оценки весьма условны.
Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование.
Фрагментация – разрушение клеток на отдельные фрагменты, которые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).
Округление – потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральном жидкости, где и погибают (энтеровирусы, аденовирусы и др.).
Симпластообразование – растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются (главным образом по периферии) ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы с многими клеточными ядрами называются симпластами (гигантские многоядерные клетки).
РГАд.Гемадсорбция – соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток – впервые была обнаружена Фогелем и Щелоковым (1957) на культуре ткани, инфицированной вирусом гриппа. В основе этого явления лежит родство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицированных клетках.
Методика РГАд состоит в следующем. На 3–4-й день после инфицирования клеток берут две пробирки с одинаковой культурой клеток, из которых одна заражена вируссодержащим материалом, а вторая контрольная. Из обеих пробирок сливают культуральную жидкость и вносят в обе по 2–3 капли 0,5%-ной суспензии отмытых эритроцитов. Обе пробирки оставляют на 5–10 мин так, чтобы эритроциты были на поверхности клеток (кладут горизонтально на стол), а затем слегка споласкивают физраствором и исследуют под микроскопом (малое увеличение). В контрольной пробирке эритроциты полностью удаляются с физраствором, а некоторые из оставшихся плывут вместе с жидкостью. Если в зараженной пробирке эритроциты не удалились с физраствором и не плывут, а прикреплены к поверхности клеток, следует считать РГАд положительной.
В зависимости от вируса и вида клеток расположение эритроцитов может быть трояким:
– эритроциты адсорбированы только по периферии клеточного пласта в виде «ожерелья» (вирус африканской чумы свиней);
– эритроциты расположены на слое клеток очагами или скоплениями (вирус гриппа);
– эритроциты расположены на слое клеток диффузно (вирус парагриппа).
Каждый вирус способен адсорбировать эритроциты крови животных определенных видов.
Самостоятельная работа студентов.
1) Студенты проводят микроскопию клеточных культур (живая культура клеток, фиксированная).
2) Изучают методы обнаружения вирусов в зараженных клеточных культурах (по ЦПД, по гемадсорбции эритроцитов на монослое, по обнаружению бляшек, по обнаружению телец-включений).
Метод образования бляшек.Этот метод обнаружения вирусов технически сложнее других и применяется главным образом для титрования вирусов.
Дальбекко и Фогт в 1954 г. впервые предложили методику получения бляшек под агаром в культуре куриных фибробластов с вирусом западного лошадиного энцефаломиелита. В последующие годы многие авторы с успехом применяли этот метод при изучении различных вирусов – ящура, везикулярного стоматита, ньюкаслской болезни, чумы птиц, полиомиелита, Коксаки и др. Метод бляшек стали широко применять в вирусологии для получения чистых популяций вируса, особенно при изучении их генетических свойств. Методику получения бляшек, предложенную Дальбекко и Фогт, модифицировали, и в настоящее время есть целый ряд отличных друг от друга методов, связанных с изучением различных вирусов.
Метод бляшек основан на образовании вирусом в однослойных культурах, залитых агаровой средой, содержащей витальный краситель – нейтральрот, негативных колоний или бляшек.
Бляшки представляют собой обесцвеченные участки культуры, состоящие из погибших под действием вируса клеток. Кроме агара в целях предотвращения переноса вируса на другие места можно использовать крахмал и метилцеллюлозу. Некоторые вирусы дают бляшки без покрытия слоем агара, например вирус чумы крупного рогатого скота, осповакцины, некоторые представители вирусов герпеса и др. На клетки, промытые средой или раствором Хенкса, наносят вирус в определенных разведениях и обеспечивают контакт вируса с клетками при периодическом покачивании в точно установленный отрезок времени (1–2 ч) при 37–38 °С. Неадсорбировавшийся вирус удаляют путем промывания раствором Хенкса или отсасывают пастеровской пипеткой, затем на слой клеток наносят специальное агаровое покрытие. Выбор среды покрытия определяется видом клеток и вируса.
После застывания (30–60 мин) с поверхности агара сливают конденсированную влагу, флаконы переносят в термостат и инкубируют клетками вверх. Время инкубации и температура должны быть оптимальными для бляшкообразования, вызываемого данным вирусом. Наблюдение за появлением бляшек проводят в течение нескольких дней. За это время вирусы, адсорбировавшиеся на клетках, проникают в последние, проходят цикл репродукции, выходят из клеток и поражают соседние клетки. В сплошном слое живых клеток возникают островки мертвых, погибших вследствие репродукции в них вируса клеток. Раствор красителя окрашивает только живые клетки. Поэтому в матрасе на ровном красновато-розовом фоне появляются бесцветные пятна, которые и называются негативными пятнами Дальбекко или бляшками. Каждая бляшка соответствует островку мертвых клеток.
Цветная проба.Цветную пробу для лабораторных исследований впервые предложили Солк, Янгнер и Уорд в 1954 г. Предпосылкой для разработки данного метода явились наблюдения Эндерса, Уэллера и Роббинса, которые отметили, что в незаряженных тканевых культурах под влиянием продуктов метаболизма рН среды сдвигается в кислую сторону, что улавливается по пожелтению фенолрота, добавленного в питательную среду. В то же время жидкость в тканевых культурах, зараженных вирусом, убивающим живые клетки, сохраняла свой красный цвет.
Наиболее отчетливые результаты дают вирусы с высокой скоростью размножения при культивировании их на медленнорастущих клетках.
Так как метод цветной пробы не отличается высокой достоверностью, его в практике используют редко.
Обнаружение внутриклеточных включений.При многих вирусных заболеваниях в клетках (в цитоплазме или ядре) различных органов и тканей появляются особые образования, называемые тельцами-включениями. Их классифицируют по локализации в клетке, составу нуклеиновой кислоты, тинкториальным свойствам и гомогенности. Вирусные тельца-включения хорошо обнаруживаются в препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином. Для этого фиксированные на покровных стеклах клетки промывают в дистиллированной воде и погружают на 5–15 мин в раствор гематоксилина (гематоксилин Майера, Эрлиха, Карацци и др.).
Обнаружение вирусов в реакции иммунофлуоресценции.В том случае, если размножение вируса в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить с помощью флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусной инфекции свиней и других болезней.
Обнаружение вирусов с помощью иммунопероксидазной реакции (иммуноферментного анализа).Методика изложена в специальном разделе
Обнаружение вирусов с помощью электронного микроскопа.Методика изложена в специальном разделе.
Метод, основанный на интерференции вирусов.Построен на том, что некоторые вирусы в культуре клеток снижают способность размножаться в ней других вирусов. Например, вирус чумы свиней снижает инфекционную активность вируса ящура, вирус ньюкаслской болезни – вируса везикулярного стоматита и т. д.