Методика проведения занятия и методические указания по теме

Тема 6. Использование лабораторных животных в диагностических исследованиях. Вскрытие лабораторных животных

Задание к следующему занятию

Подведение итогов занятия

Задания

1. Отработка приемов фиксации и экспериментального заражения лабораторных животных всеми методами.

2. Заражение внутрикожно белых мышей вирусом эктромелии и кроликов вирусом осповакцины.

Самостоятельная работа студентов

Студенты отрабатывают приемы фиксации и экспериментального заражения лабораторных животных всеми методами.

Контрольные вопросы:

1. С какой целью используют лабораторных животных в вирусологических исследованиях.

2. Требования, предъявляемые к лабораторным животным, уход, содержание.

3. Животные - гнотобиоты. СПФ - животные .

4. Методы заражения лабораторных животных.

 

 

Цель занятия: Установление у зараженных животных симптомов болезни. Вскрытие зараженных животных с целью обнаружения патологоанатомических изменений и получения вируссодержащего материала. Получение отпечатков мозга.

Оборудование и материалы: суспензии вирусов эктромелии и осповакцины; кролики; белые мыши; клетки для животных; кюветы с восковым дном; стерилизаторы со стерильными инструментами (шприцами, инъекционными иглами, пинцетами анатомическими 14 и 10 см, ножницами глазными); вата; спирт; эфир для наркоза; банка вместимостью 0,5 л с крышкой; стерилизованные ватные тампоны в бумажной упаковке (ватики); стерильный физиологический раствор; фильтровальная бумага; стекла предметные; раствор пикриновой кислоты, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия

Объяснение преподавателя:

6.1 Признаки размножения вируса в организме лабораторного животного. В последующие за заражением дни ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. В случае размножения вируса в чувствительных к нему клетках организма последние повреждаются или гибнут. При значительном количестве поврежденных вирусом клеток нарушается функционирование части или всего органа. Это проявляется соответствующими изменениями в состоянии и поведении животного. Так, при размножении вируса в клетках респираторного тракта наблюдаются кашель, хрипы, одышка, при размножении вируса в клетках мозга – судороги, парезы, параличи и т. д.

Видимые изменения в состоянии и функционировании организма называют клиническими признаками болезни, а появление их после экспериментального заражения считают косвенным доказательством размножения вируса. При этом учитывают не только сам факт и характер появившихся изменений, но и продолжительность инкубационного периода, которая характерна для определенной болезни. Инкубационный период зависит не только от свойств возбудителя, но и от дозы вируса, пути его проникновения в организм и состояния самого организма.

Клинические признаки, появившиеся у лабораторных животных, зараженных с целью биопробы (обнаружения вируса), указывают на то, что в исследуемом патматериале содержался вирус. Эти признаки большей частью носят неспецифический характер (например, угнетение, снижение аппетита, одышка и т. п.), и на этом этапе исследований еще нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболевание. Для этого необходимо идентифицировать обнаруженный вирус с помощью серологических реакций. При этом неизвестным антигеном является выделенный вирус, содержащийся в материале, полученном при вскрытии использованного для биопробы животного. Нередко заболевание заканчивается гибелью, что также бывает через определенное время после заражения и служит одним из признаков размножения вируса в организме. На размножение вируса в организме указывают не только клинические признаки и гибель животного, но и видимые изменения самих органов и тканей, которые, как говорилось выше, возникают в связи с гибелью зараженных вирусом клеток. Патологоанатомические признаки выражаются изменением цвета, размера, формы и консистенции органов, а также в появлении образований, в норме не встречающихся.

Итак, три признака указывают на наличие вируса в материале, которым заражали лабораторных животных: симптомы болезни, патологоанатомические изменения и гибель. Однако не всегда названные признаки сопровождают размножение вируса в организме. Например, вирус, содержащийся в патологическом материале, полученном от лошади, не может легко и с клиническими проявлениями размножаться в организме белых мышей. В первом пассаже лишь единичные вирусные частицы найдут для себя чувствительные клетки, но их будет так мало относительно целого органа, что видимых изменений организма не возникнет. Такой пассаж получил название «слепого».

Зараженное, но не проявившее признаков болезни животное убивают через интервал времени, равный двум инкубационным периодам, и берут при вскрытии патологический материал, предположительно содержащий размножившийся и накопившийся вирус.

Суспензией из материала от первого пассажа заражают других животных того же вида. При этом в организм попадает большее, чем в первом пассаже, количество вирусных частиц, способных размножаться в таких условиях. Однако при втором пассаже вирус может также не накопиться до уровня инфекционной дозы и не вызвать видимых изменений. Тогда и второй пассаж окажется «слепым».

По тому же принципу делают третий пассаж и в случае появления признаков заболевания приходят к заключению о присутствии вируса в исследуемом материале. Полученный от реагировавшего животного вируссодержащий материал считают выделенным вирусом.

При биопробе с целью обнаружения вируса на других лабораторных живых системах поступают по тому же принципу.

Вирусы же, для обнаружения и выделения которых используют естественно восприимчивых животных, не нуждаются в предварительной адаптации и проявляют себя в биопробе определенными признаками уже на первом пассаже.

6.2 Взятие материала от лабораторных животных.Способвзятия крови опреде­ляется требуемым количеством ее. Большое количество получают путем пунк­ции сердца или из наружной яремной, бедренной, подкрыльцовой вен. Неболь­шое количество крови берут из ушной и хвостовой вен, из гребня и ретробульбарного венозного сплетения.

Пункцию сердца делают у мышей, крыс, хомяков, кроликов, морских сви­нок, собак и кур. При этом методе бывают смертельные случаи, особенно у мышей, крыс, хомяков и морских свинок.

Из наружной яремной вены кровь берут у хомяков, морских свинок, хорьков, кроликов, собак и кур в тех случаях, когда не удается взять кровь путем пункции сердца. Вена должна быть обнажена, животные (кроме кур) находятся под нар­козом. Из бедренной вены кровь берут у мышей, крыс, хомяков. Для этого животное фиксируют в положении на спине под наркозом. После подготовки операцион­ного поля разрезают кожу на внутренней стороне бедра и обнажают сосуд. У мелких лабораторных животных пункция этого сосуда невозможна, поэтому венунадрезают и кровь собирают в кожном кармане. После тампонады рану закрыва­ют. У собак кровь берут из v. saphena parva после фиксации животного в положе­нии на боку. Сдавливают бедро. Пункцию по возможности следует делать дистально в нижней трети голени на латеральной стороне.

У кур кровь берут из подкрыльцовой вены (v. cutanea ulnaris). С этой целью фиксируют птицу на спине, распрямляют крыло и сдавливают вену. Обрабатывают кожу спиртом. Так как ввести иглу в вену трудно, прокалы­вают ее скальпелем и собирают появившуюся кровь. Из гребня кровь берут, прокалывая его или отрезав зубец. Чтобы предупредить кровотечение, рану пос­ле взятия крови следует прижечь или обработать хлоридом железа.

У кроликов кровь получают из ушной вены после сдавливания у основания уха. У мышей, крыс и хомяков кровь обычно берут из хвостовой вены. Опера­цию выполняют под наркозом. Обрабатывают хвост спиртом, ксилолом или по­гружают его в теплую воду (45 °С) на 1 мин и удаляют кончик хвоста ножница­ми. У мышей, крыс и хомяков можно взять кровь (под наркозом) ретробульбарного сплетения. Животных фиксируют между большим и указательным пальца­ми. Надавливая на шею, задерживают кровообращение в сосудах головы, о чем свидетельствует выпячивание глаз. В медиальный угол глаза вводят капилляр­ную пипетку и направляют ее в сторону гортани. При повреждении венозного сплетения кровь попадает в пипетку. После взятия крови животным подкожно вводят стерильный физиологический раствор: кроликам – 20 мл, морским свин­кам – 10, мышам – 1–2 мл.

Для получения сыворотки кровь около 1 ч выдерживают в теплом месте (30 – 37 °С), сгусток обводят металлической или стеклянной палочкой и ставят на ночь в холодильник. Сыворотку отсасывают пипеткой в стерильный сосуд, филь­труют или добавляют антибиотики (по 100–200 ЕД пенициллина и стрептоми­цина на 1 мл) и консервируют (мертиолат натрия, тимол, азид натрия и др.). Хранят сыворотку на холоде, лучше при замораживании (минус 10 – 20 °С).

По методу Робино для получения взвеси лейкоцитов к 30 мл крови добавляют гепарин из расчета 0,0001 мг на 1 мл крови. Смесь инкубируют в наклонном положении под углом 45° при 37 °С до полного оседания эритроцитов. Для уси­ления оседания добавляют 3 % взвесь поливинилпирролидона из расчета 20–40% от объема крови. Полностью эритроциты оседают в течение 30–40 мин. Надосадочную жидкость центрифугируют при 1500 об/мин 2 мин,при этом лейкоциты выпадают в осадок. После удаления надосадочной жидко­сти осадок разводят 5 мл физраствора (рН 7,0), который добавляют по каплям. Лейкоциты осаждают в течение 30 мин. Осадок дважды отмывают физраство­ром. Получают гомогенную массу, состоящую из лейкоцитов.

По методу Ванцетти и Каудиана к 6 мл крови в градуированной пробирке добавляют 1,5 мл 3%-ной суспензии гуммиарабика и 1,5 мл 3%-ного цитрата натрия нейтральной реакции. Смесь взбалтывают и оставляют на 30 – 40 мин для осаждения эритроцитов. Снимают поверхностный слой и центрифугируют при 1000 об/мин 3 мин. Осадок суспендируют в физиологическом растворе.

Операцию по обескровливанию животных выполняют под наркозом. Мы­шей, хомяков и крыс обескровливают путем вскрытия шейных сосудов и соби­рают вытекающую из раны кровь. Морских свинок, собак, кроликов фиксируют на спине и после соответствующей подготовки обнажают сонную артерию, на­кладывают две лигатуры и между ними рассекают. Конец сосуда, идущий к сер­дцу, обнажают и, направив его в стерильную посуду, снимают лигатуру. Можно использовать также иглу для пункции.

6.3 Вскрытие лабораторных животных. После окончания опыта оставшихся в живых лабораторных животных умерщ­вляют. Мышей, крыс, хомяков и кроликов помещают под стеклянный колпак, в который кладут ватный тампон, смоченный эфиром или хлороформом, – жи­вотное умирает. Собаке внутривенно вводят хлоралгидрат в дозе не менее 0,5 г на 1 кг массы. Можно также инъецировать 20–40 мл насыщенного раствора сульфата магния. Курам отрезают голову или оглушают ударом по голове и пере­резают шейные сосуды. Убить животное можно избыточной дозой наркоза, а также (мелких животных) путем разрыва спинного мозга. Для этого тело животного, удерживая правой рукой за затылок, а левой за хвост, быстрым коротким движением растягивают до ощущения обрыва нити. Менее гуманный метод умерщвления – декапитация (отрезание головы).

Для изучения патологоанатомических изменений и получения вируссодержащего материала экспериментально зараженных животных вскрывают. Делают это сразу же после гибели их, что предотвращает обсеменение органов и тканей микрофлорой, находящейся при жизни животного на поверхности слизистых оболочек, особенно в кишечнике. Если зараженное животное не погибло, его убивают в момент максимального проявления симптомов болезни или при их отсутствии на 8–10-й день после заражения.

Для удобства вскрытия труп животного фиксируют. Более крупных животных укрепляют на специальных вскрывочных столиках или на доске с приспособлением для фиксации конечностей и головы. Мелких животных целесообразно фиксировать в кювете с залитым воском (парафином) и покрытым бумажной салфеткой дном. Для фиксации используют инъекционные иглы или одностержневые булавки (портновские). Вскрытие выполняют стерильными инструментами.

Брюшную и грудную полости вскрывают при фиксации животного в спинном положении с направленными в стороны и укрепленными передними и задними конечностями (рис. 12).

Шерсть животного по линии разреза обрабатывают дезинфицирующим раствором. Мелких животных перед вскрытием можно опускать полностью в дезинфицирующий раствор, держа за хвост.

Разрез кожи делают по белой линии от лонной кости (симфиза) до шеи. Чтобы при этом не прорезать брюшную стенку, пинцетом, находящимся в левой руке, приподнимают кожу и делают сначала поперечный надрез складки кожи, удерживаемой пинцетом у симфиза, а затем, вставив одну браншу ножниц в образовавшееся отверстие, разрезают кожу до шеи животного, после чего кожу разрезают по направлению к каждой из четырех конечностей. Тупым путем кожу отпрепаровывают, открывая ее лоскуты вправо и влево наподобие дверок шкафа. Лоскуты кожи фиксируют булавками за верхние и нижние углы.

Рисунок 12. Порядок вскрытия грудной и брюшной полостей (по Вагнеру)

Заменив инструменты, вскрывают брюшную полость. Для этого разрез брюшной стенки делают под линией диафрагмы и по белой линии до лонной кости. Треугольники брюшной стенки отводят в стороны и фиксируют.

В качестве вируссодержащего материала из брюшной полости берут кусочки (или целый орган у мелких животных) печени, селезенки, почки, брыжеечные лимфатические узлы, участок кишечника при наличии патологоанатомических изменений или симптомов болезни, наблюдавшихся перед смертью.

Грудную полость вскрывают с учетом того, что она имеет твердые стенки. Для получения доступа к находящимся в ней органам с нее надо как бы снять «крышку». Для этого разрезают ребра поперек сзади вперед, удаляя их вместе с грудной костью.

Череп вскрывают, укрепив животное в брюшном положении путем фиксации передних конечностей и головы (рис. 13). Кожу головы и шеи обрабатывают дезинфицирующим раствором.

Рисунок 13. Порядок вскрытия черепной полости

Разрез кожи делают перпендикулярно оси тела за ушами, продолжают слева и справа вперед к глазницам. Кожу вместе с ушами отпрепаровывают и отбрасывают вперед, оголяя черепную коробку. Одну браншу ножниц вставляют в большое черепное отверстие и режут кости черепа влево и вправо по направлению к глазницам. Затем разрезают кости черепа между глазницами и удаляют весь вырезанный участок. Если кости черепа толстые, их распиливают по тем же направлениям. Можно разрезы черепа вести от глазниц назад.

Мозг животных, имеющий мажущуюся мягкую консистенцию, извлекают из основания черепа, подняв его слегка раздвинутыми браншами ножниц и подрезав черепно-мозговые нервы.

Основное требование к вируссодержащему материалу–максимальное содержание в нем вируса, что определяется тропизмом вируса, т.е. способностью его размножаться в определенном типе клеток, а следовательно, и в соответствующих органах животного. Поэтому, вскрывая животное, обращают внимание на то, какие органы имеют патологоанатомические изменения, т.е. предположительно содержат вирус. Измененные органы берут в качестве вируссодержащего материала. Одновременно с той же целью берут регионарные пораженному органу лимфатические узлы.

При заражении животных пневмотропными вирусами в качестве вируссодержащего материала берут легкие, средостенные лимфатические узлы, трахею. Висцеротропные вирусы содержатся в паренхиматозных органах брюшной полости (в печени, селезенке), брыжеечных лимфатических узлах и стенке кишечника. Для исследований нейротропных вирусов берут головной, а если надо, то и спинной мозг.

Каждую пробу материала, разделив на две части, помещают отдельно в две стерильные пробирки, закрытые резиновыми пробками. Ткань одной пробирки предназначается для вирусологических исследований, поэтому ее сразу же заливают соответствующим фиксатором. В тех случаях, когда в комплексе диагностических исследований на определенную инфекцию предполагаются микроскопические методы обнаружения вируса (световая, люминесцентная микроскопия), из вируссодержащих органов делают мазки или отпечатки. Учитывая, что специфические для вируса изменения могут быть локализованы в различных отделах органа (например, в мозге при бешенстве), отпечатки готовят следующим образом: мозг мелкого животного из вскрытой черепной полости, не повреждая структуры, переносят на лист (10x10 см) фильтровальной бумаги, где он достаточно прочно фиксируется. Браншами глазных ножниц отрезают по вертикальной плоскости небольшой кусочек его и кладут на бумагу рядом. Затем отрезают следующий слой мозга и также кладут рядом и т. д. Взяв в левую руку лист бумаги с фиксированными на нем кусочками мозга, правой рукой прикладывают сверху к каждому поочередно предметное обезжиренное стекло, получая отпечатки.

Демонстрация:а) клинических признаков заболевания у зараженных лабораторных животных; б) методов умерщвления лабораторных животных; в) техники вскрытия (обращают внимание студентов на состояние внутренних органов) и приемов получения вируссодержащего материала; г) техники изготовления отпечатков мозга; д) действий по обеззараживанию рабочего места и трупа после вскрытия зараженного животного.

Самостоятельная работа студентов: а) распознавание по цветной метке зараженных каждым из студентов мышей, анализ их клинического состояния, умерщвление, фиксация в кювете с восковым (парафиновым) дном, вскрытие; б) анализ патологоанатомических изменений, получение вируссодержащего материала (паренхиматозных органов), приготовление послойных отпечатков мозга