Молекулярно-абсорбционная спектроскопия

В основе молекулярного спектрального анализа лежит качественное (идентификация) и количественное определение индивидуальных веществ или вещества в смесях, основанное на избирательном поглощении молекулами (атомами) вещества электромагнитного излучения. Может быть исследовано как известное молекулярное вещество, так и новые молекулы или иные частицы (ионы, радикалы и др.), а также различные конформеры одних и тех же молекул. Информативность метода определяется строгой индивидуальностью спектра молекул, а сочетание методов анализа по нескольким видам спектров еще более увеличивает надежность определения состава анализируемой пробы. Установлены общие закономерности, связывающие спектр вещества с его строением.

Существует несколько молекулярно-абсорбционных методов: ^колориметрический - основанный на визуальном сравнении окраски анализируемого и стандартного раствора одного и того же вещества (подробнее о нем см. в разделе 5.1.4);

S фотоколориметрический - этот метод основан на фотометрическом измерении (с помощью специальных светочувствительных датчиков) .интенсивности прошедшего через вещество интегрального светового потока (свет всех длин волн);

•S спектрофотометрический - в этом методе измеряется (также с помощью специальных светочувствительных датчиков) интенсивность прошедшего через вещество монохроматического светового потока, причем для каждой длины волны излучения проводится отдельное измерение. В последнем случае методы молекулярного спектрального анализа основаны на сравнении измеренных молекулярных спектров исследуемого образца со стандартными спектрами индивидуальных веществ. В настоящее время созданы приборы, совмещенные с компьютером, которые в процессе съемки спекгра, с помощью специальной программы идентифицируют его и выдают результат анализа в виде формулы вещества с указанием его количества в пробе.

Молекулярный спектр является однозначной характеристикой молекулы, определяется ее свойствами в целом и в первую очередь структурой и свойствами входящих в нее атомов. Он возникает при переходе электронов с основных термов молекулярных орбитатей в возбужденные состояния и может наблюдаться в ультрафиолетовой, видимой и ближней инфракрасной областях (120 - 1000 нм). Энергия переходов составляет 120 - 1000 кДж/моль (30 - 240ккал/моль). При поглощении такой энергии одновременно происходит и изменение в колебательно-вращательных состояниях молекулы, вследствие чего электронные спектры представлены широкими полосами. В разбавленных растворах и парах некоторых соединений полосы электронных переходов расщепляются на более узкие (вращательные и колебательные структуры), характеризующие изменение колебательной и вращательной энергий в возбужденном электронном состоянии.

Основными факторами, определяющими возможности методов молекулярного спектрального анализа, являются:

•S информативность метода, которая выражается числом спектрально разрешимых полос в определенном интервале длин волн (частот) исследуемого диапазона;

S количество измеренных спектров индивидуальных соединений; S существование однозначной связи между строением вещества и его спектром; •S чувствительность и избирательность метода;

Различают качественный и количественный молекулярный спектральный анализ (МСА). Качественный МСА позволяет по молекулярным спектрам идентифицировать индивидуальные вещества или устанавливать молекулярный состав исследуемого образца. Количественный МСА основан на двух спектральных законах, справедливых для монохроматического излучения, которые устанавливают соотношения между величиной поглощения электромагнитного излучения и количеством поглощающего вещества, поэтому количественный молекулярный спектральный анализ, основывающийся на получении и изучении спектров поглощения, часто называется абсорбционной спектроскопией.

Как было показано выше, при прохождении монохроматического электромагнитного излучения через поглощающую среду интенсивность прошедшего светового потока 7 становится меньше интенсивности падающего потока /„ (рис.5.1.1.1). Причем, чем больше поглощающих энергию центров встретится на его пути, тем больше излучения поглотится. Отношение этих двух величин, выраженное в процентах, называют пропусканием (прозрачностью) образца. Очевидно, что для прозрачных растворов Т s 100%, а для непрозрачных он равен нулю.

Бугером еще в 1729 году сформулирован закон (2.2.6.12), выражающий зависимость между интенсивностью прошедшего излучения и толщиной слоя поглощающего вещества

Закон открытый Бугером был модифицирован в 1862 г. Бэром для растворов, поглощающих свет веществ. Бэр установил связь между интенсивностью прошедшего излучения (плотностью потока энергии прошедшего через вещество) и концентрацией поглощающего вещества в растворе. Предполагается, что каждый луч в потоке параллельных лучей монохроматического излучения проходит в растворе одинаковый путь, а каждый элемент объема раствора содержит растворенное вещество в равной концентрации С. Тогда, при прохождении света через раствор вещества концентрации С, поглощающего свет, световой поток ослабляется

Безразмерная величина D называется оптической плотностью. Этот закон получил название закона Бугера - Бэра1. Если концентрация выражена в молях на дм (часто ее выражают в молях на литр, см. С. 22), а толщина слоя в сантиметрах, то коэффициент поглощения называется молярным коэффициентом поглощения (или молярной экстинкцией).

Закон Бугера-Бэра успешно описывает абсорбционные свойства только разбавленных растворов и имеет ряд иных исключений, которые следует учитывать при проведении исследований. Экспериментальная проверка закона заключается в исследовании зависимости оптической плотности от концентрации при данной длине волны излучения. Например, при разбавлении раствора дихромата калия происходит не только пропорциональное сокращение концентрации оптически активного ион дихромата, но и протекают процессы химического взаимодействия:

 

Рассмотрим подробнее спектрометрию в УФ и видимой областях спектра,

Еще в прошлом столетии окраску веществ связывали с их строением, считая, что цвет соединения обуславливается наличием ненасыщенных группировок. В 1876 г. Витт ввел для таких группировок термин "хро-• мофоры". Тогда же было введено понятие "ауксохромы" для групп, не имеющих собственно- . го поглощения в видимой области, но углубляющих окраску хромофоров. Впоследствии понятие "хромофоры" распространилось на группировки не только в видимой, но и в ультрафиолетовой области.

При описании спектров в УФ и видимой областях были введены термины: S гипсохромный сдвиг (синий сдвиг) - для смещения полос поглощения

в коротковолновую область; ,

S батохромный сдвиг (красный сдвиг) - для смещения полос поглощения в сторону длинных волн;

J гиперхромный эффект - увеличение интенсивности поглощения; */ гипохромный эффект - уменьшение интенсивности поглощения. Все приведенные термины используются и в настоящее время. Для установления связи электронных спектров (в УФ и видимой областях) со строением органических соединений необходимо сделать отнесение полос поглощения к определенным электронным переходам. Теория электронных спектров основывается на квантово-механических представлениях. Для атомов, входящих в состав молекулы, внутренние электроны атомов и электроны, не участвующие в образовании молекулярных связей, сохраняют ту же энергию, что и в индивидуальном атоме (находятся на . атомных орбиталях). Валентные же электроны располагаются на новых энергетических уровнях, отличающихся от атомных. Эти уровни - молекулярные орбитали (МО) складываются из линейных комбинаций отдельных атомных орбиталей, плюс энергия межъядерного взаимодействия атомов, составляющих молекулу (конфигурационный вклад). Таким образом, вклад в энергию этих орбиталей вносят как энергии валентных электронов атомов, так и энергия межатомных взаимодействий.

Выше было показано, что в атомах электронные энергетические уровни жестко фиксированы, но энергия межъядерного взаимодействия может изменяться в широких пределах вследствие тепловых колебаний и вращений атомов, поэтому энергия молекулярных орбиталей, в отличие отатомных,

не имеет жесткой фиксации и может варьировать около какого-то среднего значения. В молекулярный спектр поглощения образца, состоящего из очень большого количества одинаковых молекул вносит вклад каждая молекула, и спектр поглощения состоит из множества очень близко расположенных спектральных линий, сливающихся в полосу поглощения. Величина отклонения от среднего значения зависит от температуры исследуемого образца (чем выше температура, тем больше отклонение), а само среднее значение определяется орбиталями валентных элекгронов атомов, составляющих молекулу. Каждая молекула имеет набор МО со своими энергиями.

В органических соединениях поглощение в УФ и видимой областях связано с переходами валентных электронов одинарных и кратных связей (сг - и п -электроны) и электронов неподеленных пар гетероатомов (п -электроны)1. Последовательность энергетических уровней электронов в молекуле органического соединения можно представить в виде:

Таким образом, спектр поглощения молекулы характеризуется наличием в нем определенного числа полос поглощения. Каждая полоса имеет максимум поглощения и ширину. Она характеризуется молярным коэффициентом поглощения в максимуме полосы Game и шириной полосы а, опреде-ляемой на половине высоты пика, примерно так, как показано на рис. 5.1.1.4. Чем выше молярный коэффициент поглощения Емакс и уже ширина полосы, тем более ценным химико-аналитическим свойством обладает соединение, потому что эти характеристики определяют очень важные показатели - предел обнаружения вещества и селективность такого обнаружения.

Непоглощающие вещества переводят в поглощающие с помощью реагентов. Разработано несколько десятков тысяч фотометрических реакций, получивших широкое распространение как в органическом, так и в неорганическом анализе. Для успешного применения таких реагентов в количественном анализе необходимо добиться максимально полного протекания реакции образования окрашенных соединений.

Продукт фотометрической реакции должен быть устойчив, иметь постоянный состав, обладать достаточной интенсивностью окраски, обеспечивающей надежное определение микрокомпонентов (т. е. иметь низкий предел их обнаружения). Кроме того, должна наблюдаться контрастность реакции. Последнее свойство определяется разностью положения полос поглощения исходных веществ и продуктов реакции. Желательно, чтобы реакция была избирательной.

Спектрометрический анализ неорганических веществ в УФ и видимой областях основан в большинстве случаев на реакциях комплексообразова-ния. Например, определение РЬ2+ и Zn2+ с дитизоном, Fe + с сульфосалици-ловой кислотой или тиоцианатом калия, Си24 с аммиаком или диэтилкар-бамидом.

Для анализа органических соединений используют реакции, Основанные на получении азокрасителей, хинониминовых и полиметиновых соединений, окрашенных продуктов окисления, экстрагирующихся ионных ассоциатов и другие. Так, нитриты определяют по реакции получения азо-красйтеля с реактивом Грисса. Карбонильные соединения, например, кето-ны при конденсации с аминами образуют окрашенные основания Шиффа:

Часто идентификация вещества проводится по его спектрам поглощения в различных растворителях, при этом определяется число полос поглощения, их параметры Лжкс и емтс, а затем полученные данные сравнивают с соответствующими характеристиками веществ известного состава. Для этих целей используют растворители, которые не имеют полос поглощения в данном частотном диапазоне. Интенсивность поглощения органических соединений может быть очень высокой, и величина е может достигать значений свыше 100 000. Это заставляет изучать электронные спектры в сильно разбавленных растворах (концентрации раствора от 10"2 до 10" моль/л). В качестве растворителей используются предельные углеводороды, вода, спирты, галоидопроизводные, простые эфиры, кислоты и т. д. В табл. 5.1.1.3 приведены наиболее часто употребляемые растворители и коротковолновые границы их поглощения (нижние пределы пропускания). Кроме того, следует отметить, что в области частот ниже 195нм поглощает атмосферный кислород, а это требует проведения исследований в атмосфере азота или в вакууме. Ниже 160 нм поглощает и азот, поэтому в этой области излучений используются только вакуумные приборы.

Итак, молекулы, содержащие хромофорные группы, обладают характерными полосами поглощения, что позволяет их использовать для идентификации соединений по спектрам в видимой и ультрафиолетовой областях. Идентификация органических соединений производится либо вручную, на основании анализа каталогов известных спектров соединений, либо с помощью специальной компьютерной программы, разработанной учеными Сибирского Отделения РАН, и которая содержит постоянно пополняемый банк данных по нескольким сотням тысяч соединений.

Рассмотрим аппаратурное обеспечение измерений светопоглощения в УФ и видимой области.

Спектры в области 195 - 1000 нм исследуются при помощи специальных приборов, основанных на оптических методах разложения излучения. Эти приборы, называемые спектрофотометрами, должны выполнять две основные задачи: S разложение диффузного излучения на монохроматические компоненты или выделение из всей области достаточно узкого интервала длин волн; S измерение величины энергии или количества квантов поглощенного веществом света.

При широком многообразии схем и конструктивных решений, все приборы, предназначенные для решения задач абсорбционной спектроскопии, содержат несколько основных функциональных узлов, к которым относятся широкополосный источник диффузного излучения, монохроматор, служащий для разложения диффузного излучения на монохроматические компоненты (для выделения из всей области излучения узкого интервала длин волн), кюветного отсека, куда помещаются кюветы с растворами исследуемого вещества и холостой пробой, приемника излучения и регистрирующего устройства. На рис. 5.1.1.6 приведена принципиальная блок-схема такого устройства

Все спектрофотометры, по методике проводимых измерений, делятся на два типа - однолучевые и двухлучевые. В однолучевых приборах излучение пропускается вначале через кювету, содержащую раствор, а затем через кювету сравнения.

Схема простейшего однолучевого спектрофотометра приведена на рис. 5.1.1.7. Источником излучения в большинстве подобных приборов служит водородная лампа (на область 195 - 350 нм) и лампа накаливания, .(в области 350 -1000 нм), В качестве . приемника, излучения используется . полупроводниковый . фотоактивный эле-

мент, сигнал с которого после усиления выводится на самописец или стрелочный прибор, отградуированный в единицах оптической плотности. Монохроматор представлен либо призмой, с помощью которой происходит разложение диффузного света излучаемого источником в спектр, либо набором специальных светофильтров, пропускающих излучение только в узком диапазоне частот. Все оптические системы спектрофотометров изготавливаются из кварца. Растворы исследуемого вещества помещаются также в кварцевые кюветы.

Для автоматической компенсации полос растворителя применяются двухлучевые спектрофотометры, работающие по так называемому нулевому методу. Принципиальная схема двухлучевого прибора приведена на рис. 5.1.1.8.

От источника излучения 1 световой поток при помощи диафрагм и системы зеркал разделяется на два равноценных потока (луча). Один луч проходит через кювету 11, в которой находится растворенное вещество, а другой через кювету сравнения 2, в которую налит только растворитель. Оба световых потока проходят модулятор 4 - быстро вращающуюся зеркальную пластину, устроенную так, что, вращаясь, она поочередно перекрывает один из лучей и пропускает другой. Лучи, пройдя модулятор 4, попадают поочередно во входную щель монохроматора 5, где разлагаются призмой или дифракционными решетками спектрометра. Узкий участок спектра лучей подается на фоточувствительное устройство 6, в котором световой поток преобразуется в соответствующий ему электрический сигнал. Электрические сигналы поступают на устройство сравнения 7, которое вычитает один сигнал из другого. Разность двух сигналов подается на усилитель 8 и самописец 10, система управления которым отградуирована в процентах пропускания (или оптической плотности). Для установления равенства световых потоков в каждом из лучей служит серый клин 3, экранирующий поток сравнения до тех пор, пока его интенсивность не станет равной интенсивности рабочего потока, при этом разность сигналов каналов равна нулю. Сравнение интенсивносгей и приведение их к нулю производится автоматически в специальном режиме работы прибора с помощью устройства сравнения 7 и исполнительного механизма 9, сдвигающего серый клин. Самописец 10 регистрирует спектральную кривую поглощения, состоящую из набора пиков разной высоты и ширины, укладывающихся в исследуемом диапазоне частот в УФ, видимой или.ИК области спектра.

Источником излучения в видимой и ближней ИК областях спектра является раскаленная вольфрамовая нить лампы накаливания (350-1000 нм). Для получения диффузного излучения УФ диапазона используют водородные или криптоновые лампы, а-для получения мощных световых пучков - ртутные лампы высокого давления (195-350 нм). ИК излучение получают с помощью специальных.источников, выполненных из платины или токопроводящей керамики и называемых глобарами.

В качестве монохроматоров в последние годы все чаще используют дифракционные решетки, которые имеют перед призмами ряд преимуществ, к которым в первую очередь следует отнести их низкую стоимость, более высокую разрешающую способность; надежность в работе и миниатюрность. Светофильтры, пропускающие излучение ограниченного диапазона волн, не позволяют получать монохроматические пучки излучений, но вследствие своей крайней дешевизны они получили распространение при производстве недорогих спектральных приборов, предназначенных для проведения рутинных исследований.

Все элементы оптической системы прибора, в том числе и рабочие кюветы, должны быть максимально прозрачны. Наиболее широко распространенным материалом для этих целей является кварц. Кюветы из кварца, несмотря на их более высокую стоимость по сравнению со стеклянными, нашли повсеместное применение в лабораторной практике. Для измерения спектров в области ИК диапазона кварц и стекло не годится: они имеют в ИК области очень высокие экстинкции, поэтому в ИК исследованиях применяют солевую оптику (чаще всего изготовленную из NaCl, KBr, LiF). Соли галогенидов очень гигроскопичны, поэтому работа с ИК спектрофотометрами и оборудованием к ним требует особых условий и навыков. Когда возникает необходимость в измерении спектра поглощения твердых образцов, то образец истирается в порошок, и из этого порошка формируют специальные таблетки: запрессовывая вещество в матрицу такого вещества, которое не имеет полос поглощения в исследуемой области, и снимают спектр этих таблеток, либо готовят суспензию на основе связующего, например, вазелинового масла и определяют спектр поглощения этой суспензии. Подобные методики исследований наиболее часто встречаются в ИК спектроскопии.

Приемники излучения (детекторы) могут быть самыми разнообразными, но в их построении существует два принципиально разных подхода, в первом случае определяется величина энергии светового потока, попавшего на датчик, во втором случае измеряется количество фотонов, достигших датчика. Более точен второй метод, но он более сложен в реализации. Как в первом, так и во втором случае, сигнал, поступивший на датчик, усиливается и фиксируется регистрирующим устройством, к которым относятся самописец, принтер, фотобумага, экран осциллографа и т. д. Самый простой метод регистрации - визуальный, при этом сигнал от датчика после усиления выводится на стрелочный прибор, а показания прибора считываются лаборантом.

Колориметрия (измерение цвета объектов)

Как было показано окрашивание веществ в тот или иной цвет связано с их взаимодействием с видимой частью спектра электромагнитных волн. Если окрашенное твердое тело облучать белым светом, то часть излучения видимой области спектра поглощается этим веществом и возникающая при этом окраска вещества отвечает непоглощенной части светового потока и соответствующим ей частотам электромагнитных волн. То есть между спектром поглощения и спектром отражения вещества обычно существует однозначное соответствие и свет, отражаемый объектом, визуально можно определить как цвет.

Всякий цвет, соответствующий определенной длине волны, называется спектральным1. Спектральными являются все цвета радуги, но далеко не все цвета, встречающиеся в природе. Например, если произвести спектральное разложение пурпурного тона, то выяснится, что он содержит синий и красный цвета. ,

Основой математического описания цвета в колориметрии является экспериментально установленный факт, что любой цвет (-цветность объекта) можно представить в виде смеси (суммы) определенных количеств трех линейно независимых цветов, то есть таких цветов, каждый из которых не может быть представлен в виде суммы каких-либо количеств двух других цветов. Эти цвета определяют цветовую координационную систему. В этой системе любой цвет можно представить в виде вектора в трехмерном пространстве. Из опыта мы знаем, что сумма двух цветов дает новый цвет, который получается векторным суммированием первых двух. Если диаграмму упростить, приведя все три цвета и их комбинации к одной интенсивности, а затем спроектировать все построение из трехмерного пространства на плоскость так, как это сделано на рис. 5.1.2.1, получится график цветности, называемый также стандартной диаграммой цветности.

Из него следует, что любой цвет, полученный смешением двух заданных цветов, изображается точкой, лежащей на линии, соединяющей оба выбранных цвета. Например, смесь, составленная из равных частей обоих цветов, лежит на середине соединяющего их отрезка; смесь из 1/4 одного и 3/4 другого цвета лежит на расстоянии 1/4 отрезка. Таким образом, .цветность как "качество" цвета геометрически характеризуется "единичной" плоскостью цветности, проходящей через три единичные точки координатных осей. Линии пересечения единичной плоскости с координатными плоскостями образуют на ней так называемый цветовой треугольник.

Если в качестве основных цветов выбрать красный, зеленый и синий, то все цвета, полученные из них, лежат внутри треугольника, обозначенного пунктиром на рис. 5.1.2.1. Указанные цвета выбраны прежде всего потому, что глаз человека имеет рецепторы (колбочки), обладающие максимальной чувствительностью именно в этих областях. Представленный график цветности построен на обширных эмпирических данных и является физиологической цветовой координатной системой. На рис. 5.1.2.2 представлены кривые спектральной чувствительности для рецепторов, воспринимающих три основных цвета.

Измерение цвета, таким образом, можно производить спектрофотометрическим методом, независимо измеряя спектральное распределение энергии излучения в каждом из трех линейно независимых цветов, представленных соответствующими областями спектра.

Относительно хорошо развита метрология цвета мяса. Кроме субъективных оценок цвета, часто Недостаточных, применяют объективные спек-трофотометрические измерения, что связано с тем, что в технологических исследованиях измерение цвета является второй по важности, после измерения активной кислотности, качественной проверкой испытуемого образца. В исследовании процессов, связанных с сохранением окраски (например, посол мяса), оно выдвигается на первое место.

Мясо имеет специфический цвет, благодаря пигменту миоглобину, содержащему хроматическую группу - гем - в виде порфиринового кольца со встроенным атомом железа. Миоглобин содержится в мышечной ткани, но количество его различно. Особенно мало его у молодых животных, поэтому, по цвету мяса можно судить о возрасте животного, а также соотношении между мышечной, жировой и соединительной тканями. Большая реакционная способность миоглобина связана с его физиологической функци-

ей, заключающейся в адсорбции кислорода из гемоглобина крови шга атмосферы при хранении мяса. Вследствие этого он может давать производные различного цвета, см. схему, приведенную на рис. 5.1.2.3.

С технологической и товароведческой точек зрения, превращения, в результате которых мясо теряет характерный красный цвет, нежелательны, и закрепление цвета в ряде случаев является основной целью технологического процесса.

Достаточно точным методом является измерение спектра отражения испытуемого образца. Измерение спектру выполненное в диапазоне А = 380 - 760 нм, открывает возможность определения параметров цвета согласно расположению и интенсивности основных полос поглощения.

Приборами, предназначенными для этой цели, также могут служить спектрофотометры. Для измерения отраженных спектров мяса и мясных изделий применяют спектрофотометры различных типов. Можно указать, на спектрофотометр "Unacam SP-500", Бекмана (типа DU), Зесса, Жолина и Ивона типа Мовок. Эти аппараты отличаются лишь конструкцией при сходном принципе действия.: Фотоколориметры, как было показано в предыдущем разделе, отличаются от спектрофотометров, прежде всего тем, что роль монохроматора в них вы-

полняют большее или меньшее количество светофильтров, устанавливаемых на пути светового пучка. • '

' Такие'же аппараты, Но не снабженные фотоэлементами и в которых глаз проводящего измерения играет роль прибора сравнения двух световых пучков, называется колориметром. Схима простейшего колориметра при-' ведена на рис. 5.1.2.4. "-'

Совершенствование полупроводниковой технологии позволило заменить громоздкие электромеханические и вакуумные преобразователи света в электрический ток полупроводниковыми элементами, расширило сферы их применения, позволило изготавливать высокочувствительные .в широком спектральном диапазоне фотодатчики. В связи с этим разработаны и получили широкое распространение бесконтактные методы и средства контроля качества мяса и мясных продуктов, инструментальные методы оценки их качественных показателей.

Фирмой "Hanler Association Laboratory Inc" разработана переносная цветоизмерительная система "Miniscan", которая может применяться в пищевых перерабатывающих отраслях и в упаковочном производстве для определения цвета различных видов продуктов, включая мясные изделия, муку, специи, упаковочные материалы. Прибор работает от батареек, его масса около 2,2 кг. Характеристики цвета считываются с дисплея, а также-записываются в оперативной памяти прибора с целью последующего вывода на принтер или в память компьютера. Прибор может быть интегрирован в систему непрерывного контроля.•