Генный уровень организации наследственного материала. Современная теория гена.

ЛЕКЦИЯ № 3

 

Основополагающим моментом возникновения научных представлений в области генетики явилось открытие Г. Менделем в 1865 году законов наследования элементарных структур, названных позднее генами, и контролируемых ими признаков.

Открытие Г. Менделя, которое должно было бы провести переворот в науке о наследственности, слишком опередило свое время. Полученные им результаты и сделанные им выводы оставались незамеченными биологами в течение 35 лет после их опубликования. Официальной датой появления генетики считается 1900 год – год повторного переоткрытия законов Менделя учеными Де Фризом, Корренсом и Чермаком. После повторного открытия законов Менделя началось интенсивное исследование наследственности, что повлекло за собой появление новой терминологии. Прежде всего, сама наука получила название генетики, а менделевскую единицу наследственности стали называть генами ( Иогансен 1909г).

В 1911г. Т. Морган, К. Бриджес, А. Стертевант и Г. Миллер сформулировали хромосомную теорию наследственности, определили место положения гена в хромосомах.

В начале 20-го века большой вклад в развитие генетики внесли наши соотечественники: Белозерский, который доказал, что в состав хромосом входит ДНК, Г. Надсон и С. Филиппов, получившие искусственные мутации. Н.И. Вавилов, установивший, что у родственных видов возникают сходные мутации. Н.К. Кольцов, С.С. Четвериков, изучающих механизмы возникновения мутаций в генах различных организмах. С 40-х годов до 1956г генетика в нашей стране была запрещена. Это был период отрицания существования генов и хромосом выдвинутый Т. Лысенко. В настоящее время современная генетика занимается исследованиями наследования признаков на очень глубоком молекулярном уровне, изучена структура ДНК, гена, взаимодействия генов и т.д.

Таким образом в развитии генетики можно выделить 3 этапа. Наследование признака изучалось на: 1) организменном уровне ( работы Менделя); 2) на клеточном уровне ( Т. Морган) и на молекулярном уровне ( современный этап).

Однако, несмотря на такое усиленное развитие генетики основная концепция этой науки – концепция гена – оставалась сущностью лишенной материального содержания. Генетики не могли объяснить, как ген может управлять специфическими физиологическими процессами в клетке и как он успешно осуществляет свою собственную точную репликацию в течение цикла клеточного деления. Ответы на эти вопросы появились с началом новой эпохи генетических исследований, связанных с установлением роли молекул ДНК как хранителя и переносчика генетической информации.

История открытия химической природы генов ведет свое начало с 1928 года, когда Гриффитс провел эксперименты с заражением мышей пневмококком. Патогенность пневмококка была связана с наличием полисахаридной капсулы, которая защищала бактерию. Гриффитс работал с двумя штаммами пневмококков. S-штамм обладал патогенностью. R-штамм не обладал патогенностью. Нагревая S-штаммы Гриффитс добивался того, что пневмококки S-штамма становились непатогенными. Однако, введя смесь из живых R-штаммов и убитых S-штаммов мышам он обнаружил, что мышь погибает от « убитого» S-штамма. Это явление Гриффитс назвал трансформацией, то есть «превращением», но природу трансформирующего агента он определить не мог.

К следующему этапу исследований относится работа Эйвери, Мак-Леода и Мак-Карти, которые установили химическую природу трансформирующего агента. С помощью различных химических и ферментативных методов им удалось доказать, что трансформирующим началом служит ДНК.

Так, опыты Эвери по трансформации доказали, что ген – это участок ДНК. Другим опытом, доказывающим роль ДНК в клетке, стал опыт по трансдукции. Трансдукция – это перенос с помощью вирусов фрагментов ДНК от одной клетки к другой. В 1952 году Ледерберг и Зиндер работали с двумя штаммами 2А и 22А сальмонелл. Эти штаммы отличались разной способностью к синтезу триптофана. Штамм 2А имел ген, ответственный за синтез триптофана, поэтому мог расти на питательной среде без этой аминокислоты. Штамм 22А такой способностью не обладал. Оба эти штамма поместили в U –образную колбу, разделенную бактериальным фильтром, и через некоторое время высеяли оба штамма на питательную среду без триптофана. Удивительным было то, что штамм 22А приобрел способность расти на такой питательной среде. Это явление объяснили тем, что в бактериях в это время находились вирусы – бактериофаги. Бактериофаг состоит из белковой капсулы и молекулы нуклеиновой кислоты. Он с помощью ферментов разрушает участок клеточной мембраны и через образовавшееся отверстие вводит свою ДНК в клетку. ДНК бактериофага соединяется с ДНК бактериальной клетки и редуплицируется в составе ее генома. Количество фаговых частиц при этом быстро увеличивается. Со временем фаговые частицы разрушают бактериальную клетку и выходят в окружающую среду. При этом они уносят часть ДНК клетки хозяина. Таким образом и был осуществлен перенос с помощью бактериофага участка ДНК от штамма 2А штамму 22А.

После доказательства роли ДНК встал вопрос о роли генов в клетке. Впервые связь между генами и ферментами была обнаружена уже через несколько лет после повторного открытия законов Менделя. Исследуя родословные семей, А. Гаррод пришел к выводу, что алкаптонурия, является наследственной, причиной которой является нарушение какой-то ферментативной метаболической реакции. В 1940 году Бидл и Татум выдвинули теорию один ген – один фермент, согласно которой каждый ген имеет только одну первичную функцию, состоящую в том, чтобы направлять синтез одного фермента. Эта гипотеза была подтверждена работами многих ученых. В частности в 1949 году Лайнус Поллинг и его коллеги изучали серповидноклеточную анемию и сделали вывод, что это «молекулярная болезнь», контролируемая геном. Работы Сингера по изучению первичной структуры белка привели к уточнению гипотезы ген- фермент в гипотезу один ген – один полипептид.

Дальнейшее изучение молекулярных основ наследственности и изменчивости организмов привело к расшифровке генетического кода ДНК, выяснению механизмов биосинтеза белков в клетке и молекулярных механизмов генных мутаций. Начало расшифровке генетического кода было положено в середине XX века, когда Георгий Гамов доказал, что одну аминокислоту могут кодировать три нуклеотида ( генетический код – триплетен). В 1961 году Ниренберг, Маттеи и Очоа определили триплеты для всех 20 аминокислот. При этом было показано, что генетический код имеет вырожденный характер, что означает способность для одной и той же аминокислоты быть закодированной несколькими разными триплетами, например, аланин кодируют триплеты: АЦГ, ЦЦГ, УЦГ и ГЦГ. Генетический код обладает свойством универсальности, то есть он един для всего живого. Генетический код характеризуется неперекрываемостью. Генетическая информация считывается по триплетно, и один нуклеотид не может входить в разные триплеты.

Согласно современным представлениям ген - единица генетического материала, которая передается от родителей потомству и может быть обнаружена в эксперименте по ее способности мутировать в различные состояния, рекомбинировать с другими такими же единицами и функционировать, наделяя организм каким-либо конкретным фенотипом.

Работы Бензера, Демереца и др. помогли раскрыть молекулярные основы гена. Бензер выделял цистроны, реконы и мутоны. Наименьшей единицей рекомбинации равной двум парам нуклеотидов является рекон. Наименьшей единицей мутации также равной двум парам нуклеотидов является мутон. А наименьшей единицей функциональной активности является цистрон. Позднее цистроном стали называть участок молекулы ДНК со специфической последовательностью нуклеотидов, определяющей первичную структуру синтезируемой молекулы м-РНК и соответствующего полипептида, либо одиночной молекулы т-РНК или р-РНК. Современный период понимания гена, начавшийся с 70-х гг., связан с появлением новых знаний о прерывистой структуре генов эукариот. У эукариот в отличие от прокариот выделяют экзоны и интроны. Такое чередование интронов и экзонов определяют свойство гена – дискретность или прерывистость. Другими свойствами генов являются специфичность – в каждом гене специфичный порядок нуклеотидов, который контролирует развитие определеного признака (каждый ген отвечает за синтез одного конкретного белка); плейотропность – один ген может влиять на развитие разных признаков (Слайд № 1 )(например, доминантный ген, детерминирующий синдром Марфана, который заключается в развитии симптомокомплекса: арахнодактилия (длинные и тонкие паучьи пальцы), патология соединительной ткани (аневризма аорты), астеническое телосложение, катаракта хрусталика; градуальность, т.е. ген может усиливать степень проявления признаков при увеличении числа доминантных аллелей, например, анофтольмия, талассемия, серповидно-клеточная анемия ( у гомозигот с генотипом АА – развивается тяжелая форма анемии. Эритроциты становятся полулунной формы, теряют эластичность, становясь причиной образования тромбов. Смертность от этого заболевания продолжает оставаться высокой, особенно в детском возрасте. У гетерозигот с генотипом Аа заболевание клинически почти не проявляется. полигенность, т.е. на развитие одного и того же признака могут влиять разные гены. Большинство признаков у человека полигенные. Например, рост, цвет кожи, величина артериального давления контролируются несколькими генами; пенетрантность, то есть пробиваемость гена в признак. Пенетрантность определяется по % индивидуумов, несущих ген, у которых он фенотипически проявился. Большинство генов пробиваются со 100% пенетрантностью (полидактилия, фенилкетонурия, фруктозурия и т.д.). В некоторых случаях пробиваемость гена в признак зависит от: генотипа (шизофрения: у гомозигот проявляется со 100% пенетрантностью, у гетерозигот – с 20%), от пола (подагра: проявляемость у женщин 0%, у мужчин – 20%), от возраста ( хорея Гентин-гтона В 20-24 года пенетрантность составляет 8,3%, в 30-34 года – 18%), от факторов внешней среды (например, фенилкетонурия. При ранней диагностике и своевременном лечении – диете, не содержащей фенилаланин – пенетрантность равна 0).

Совокупность генов в клетке называется –ГЕНОМ. Ученые, конечно, еще весьма далеки от возможности расписать строение организма, исходя из последовательностей его генома. Мы на сегодняшней лекции рассмотрим лишь правила, согласно которым определенные наборы генов избирательно активируются в каждой клетке.

Хорошо известно, что ферменты в клетке представлены двумя классами: конститутивные и индуцированные.

Конститутивные ферменты бактериальной клетки встречаются всегда, они не зависят от условий окружающей среды. Что, касается индуцированных ферментов, то они образуются только при наличии определенных индукторов. Это явление получило название ферментативной индукции.

Всего лишь 40 лет назад мысль о том, что ген можно включать или выключать, казалась абсурдной. Гипотеза, сыгравшая такую важную роль в понимании работы клеток, была выдвинута на основании изучения кишечной палочки, растущей на смеси глюкозы и лактозы ( дисахарид). Если бактерии предоставляли выбор источника углерода, она сначала использовала всю глюкозу и лишь затем начинала метаболизировать лактозу. Переключение на лактозу сопровождалось остановкой роста, в течении которой синтезировался фермент - галактозидаза, гидролизирующий лактозу до глюкозы и галактозы. Выделение и характеристика мутантных бактерий, обладающих определенными дефектами в регуляции такого подключения, дало толчок биохимическим исследованиям, которые в 1961г. привели к идентификации и выделению белка-репрессора лактозного оперона у кишечной палочки.

Концепцию оперона разработали Жакоб и Моно. Согласно определению Жакоба оперон это такого рода район в ДНК, где имеется группа генов, деятельность которых контролируется единым образом.

Слайд № 3. В состав оперона входят структурные гены( А,В). – это гены, контролирующие синтез ферментативных белков, путем кодирования положения аминокислот в молекуле белка. Однако оказалось, что их эффект не является автономным и существует целая система генов, которые регулируют действие структурных генов. Эти гены называются - регуляторные.

Изучение генетического контроля утилизации лактозы в клетках кишечной палочки как раз привело исследователей к выводу о существовании белка –репрессора, который в отсутствии лактозы в среде выключает синтез - галактозидазы . Репрессор ингибирует транскрипцию лактозного оперона, связываясь с так называемым оператором.( Оператор- последовательность нуклеотидов ДНК, которая перекрывается с расположенным по соседству с участком связывания РНК-полимеразы ( промотором). До тех пор, пока репрессор остается связанным с оператором, доступ РНК-полимеразы к ее участку связывания закрыт и транскипция ближайших областей ДНК не происходит.

Белок- репрессор лактозного оперона отвечает за то, чтобы синтеза - галактозидазы, соответствовал потребностям клетки. Лактозный репрессор в свою очередь находится под контролем аллолактозы, которая образуется в клетках в присутствии лактозы. Когда внутриклеточное содержание аллолактозы достигает достаточно высокого уровня, она, выполняя функцию аллостерического регулятора, индуцирует конформационные изменения в молекуле репрессора. При этом связь его с ДНК ослабевает настолько, что он отделяется от нее, освобождается промотор и давая возможность РНК-полимеразе транскрибировать прилежащие области ДНК. В этом случае говорят о депрессии гена. Такая система регуляции позволяет кишечной палочке производить фермент, необходимый для расщепления лактозы, лишь тогда, когда это необходимо.

В опытах Жакоба и Моно были изучены основы регуляции генной экспрессии и дифференциальной активности генов ( ген работает не всегда, у каждого гена есть свое время действия и поле действия).

Что касается эукариот, включая человека, то внутриклеточная регуляция биосинтеза белков у этих организмов является гораздо более сложной и менее изученной, чем у бактерий и вирусов, что связано в первую очередь с особенностями организации их геномов. Экспрессия генов у эукариот контролируется на пяти уровнях (слайд № 3)

К числу особенностей эукариот относится прерывистая (мозаичная) структура их генов и связанный с этим процессинг РНК. В результате сплайсинга (вырезание интронов и сшивание экзонов) могут на основании одной и той же нуклеотидной последовательности гена формироваться разные варианты белковых молекул.

Предполагают, что у эукариот каждый оперон содержит один структурный ген и множество регуляторных генов. Структурные гены, ответственные за разные звенья одной цепи биохимических реакций, могут быть сосредоточены не в одном опероне, а рассеяны по геному.

У эукариот существует путь регуляции генной активности, отсутствующий у более простых форм – одновременно групповое подавление активности генов в целой хромосоме или ее большем участке осуществляется белками-гистонами, входящими в состав хромосом. В целом регуляция генной активности у выс­ших организмов менее изучена; взаи­моотношения регуляторных и струк­турных генов осложняются в силу ряда причин: наличие обособленного от цитоплазмы ядра, сложное строение хро­мосомы, дифференцировка клеток, вли­яние общих систем регуляции орга­низма, в частности гормонов, оказы­вающих сильное трансформирующее действие на проявление генной актив­ности.

У эукариот наблюдается также групповая регуляция активности генов на этапе транскрипции, связанная с особенностями организации гетерохроматиновых и эухроматиновых участков их хромосом (эухроматиновые районы хромосом генетически активны, а гетерохроматиновые генетически неактивны).

В настоящее время известны механизмы регуляции активности генов, которые действуют как на этапе трансляции происходит отбор м-РНК осуществляемое рибосомами), так и на этапе эпигенеза.

Оценивая особенности генетической регуляции биосинтеза белков у эукариот, необходимо отметить, что у многоклеточных организмов ее механизмы являются сложными, имеют многоуровневый характер и не ограничиваются лишь процессами, происходящими в рамках одной клетки. Так, для млекопитающих и человека установлено существование большого числа факторов регуляции различных надклеточных уровней (тканеспецифические и органоспецифические белки-активаторы, факторы нервной и эндокринной систем). Например, беттаглобин является тканеспецифическим белком, кодирующий его ген может активно экспрессироваться лишь в клетках красного костного мозга и у их предшественников. Детальное рассмотрение тонкой структуры гена и регуляция работы генов легло в основу центральной догмы молекулярной генетики: ( слайд № 4) ДНК ® пром-РНК ® м-РНК ® полипептид ® белок-фермент ®

признак ® варианты признака (норма и патология).-

Эта схема показывает: если все этапы реализации генетической информации в признак происходят без изменений то формируется нормальный признак. Если же на каком либо этапе происходят патологические изменения ( мутация в ДНК, нарушения при образовании м-РНК и т.д.) – это приводит к возникновению патологического признака).

Трансляция с молекул и-РНК в рибосомах происходит благодаря комплементарному соответствию кодона и-РНК и антикодона в молекулах т-РНК.

Начало прямого генетико-биохимического анализа природы кодонов было положено в 1961 г. Ниренбергом и Маттеи, которые создали простейшие синтетические полимеры и заменили ими нативные молекулы и-РНК в системе из компонентов клеток бактерий и смеси аминокислот. В смеси каждого типа одна из аминокислот была помечена радиоактивным углеродом (С¹⁴), другие 19 аминокислот не обладали меткой. Было найдено, что синтетический полирибонуклеотид, составленный только из урацилов, - полиуридиловая кислота определял синтез белка, в котором каждая аминокислота была фенилаланином. В другом опыте было показано, что полинуклеотид, состоящий только из цитозинов (поли-Ц), определял включение в белок аминокислоты пролина. Синтетические полинуклеотиды приготовлялись с использованием фермента полинуклеотидфосфорилазы. Он связывал нуклеотиды в случайном порядке. Для первых экспериментов это было достаточным, ибо в них использовались синтетические полинуклеотиды, составленные из одного типа нуклеотидов. Затем были найдены пути более сложных синтезов молекул из разных нуклеотидов с разными взаимоположениями.

Эта новая методика была широко развита Очоа и его сотрудниками. Она позволила им определить триплеты для всех двадцати аминокислот. При этом было показано, что генетический код имеет вырожденный характер, что означает способность для одной и той же аминокислоты быть кодированной несколькими разными триплетами. Например, аланин кодируется триплетами АЦГ, ЦЦГ, УЦГ и ГЦГ, в которые во всех случаях входят нуклеотиды цитозин и гуанин. К 1966 г. были изучены 61 триплет из 64 возможных. Для всех двадцати аминокислот были найдены их кодоны.

Язык, на котором клетка дает генетические приказы для синтеза молекул белков, оказался исключительно универсальным. В опыте Эренштейна и Липмана в 1961 г. молекулы и-РНК и рибосомы были взяты из ретикулоцитов кролика, а транспортная РНК – из клеток E. coli. В бесклеточной системе были синтезированы белки, аналогичные гемоглобину кролика. Такие полипептиды могли образоваться лишь в том случае, если антикодоны в транспортной РНК E. coli соответствуют кодонам в молекулах и-РНК кролика.

Огромную роль в генетическом коде играют так называемые бессмысленные триплеты. Эти триплеты не соответствуют никаким аминокислотам, и на них обрывается синтез белковой цепи. Таким образом, они играют роль пунктуации, определяя границы между генами и давая сигналы для конца транскрипции.

В некоторых условиях in vitro код может оказаться двусмысленным, это означает, что один триплет может кодировать несколько аминокислот. Так, кодон УУУ в обычных условиях кодирует аминокислоту фенилаланин. Однако, если рибосомы были обработаны стрептомицином, этот кодон начинает кодировать также изолейцин и серин. Пониженная температура и высокая концентрация ионв Mg⁺⁺ также вызывают двусмысленность в действии кода.

Генетический код характеризуется неперекрываемостью. Этот принцип был доказан исследованием мутаций, нарушающих синтез белков. В случае неперекрываемости кода изменения в одной паре нуклеотидов незбежно должны вести к нарушению в трансляции трех аминокислот, ибо при перекрещивающемся коде каждый из нуклеотидов входит в три кодона. На самом же деле эксперименты показали, что мутации изменяют транслирование только одной аминокислоты, что ясно указало на неперекрываемость кода.

Поскольку молекула ДНК имеет двунитчатый характер, представлялись возможными разные структурные характеристики кода. Возможно, что код транскрибируется с обоих полинуклеотидов. Тогда в каждой молекуле ДНК лежат две параллельные записи генетической информации. Наконец, возможно, что код транскрибируется только с одной полинуклеотидной цепи. По-видимому, последнее правильно. Причем для чтения кода in vivo вторая цепь отнюдь не инертна, она участвует в репликации новой молекулы ДНК.

Для теории генетического кода существенна характеристика протекания процесса транскрипции. Было показано, что триплетный генетический код считывается постепенно со стартовой точки в начале гена и постепенно доходит до его конца. Справедливость этой концепции была показана в опытах Крика и других, в 1961 году изучавших акридиновые мутации у фага Т4. Было показано, что действие акридиновых оснований имеет специфический характер. Акридин вызывает в нити ДНК или вставку отдельных азотистых оснований, или их потерю. Были найдены супрессорные изменения, пролившие свет на принципы транскрипции.