Определение молекулярной массы.

Наиболее надежные результаты определения молекулярной массы дает ультрацентрифугирование. Основы метода заключаются в следующем. Частицы в растворе осаждаются (седиментация), когда их плотность выше плотности раствора, или всплывают (флотация), когда их плотность ниже плотности раствора. Чем больше разница в плотности, тем быстрее идет распределение частиц. Когда плотности частиц и раствора одинаковые (изопикнические условия), частицы остаются неподвижными. При малой разнице в плотности частицы можно разделить только в центрифуге, которая создает центробежную силу, во много раз превышающую силу земного притяжения.

Величины ускорения до 10 000 g получают с помощью простой настольной центрифуги, высокоскоростные центрифуги с охлаждением позволяют достигнуть 50 000 g, а ультрацентрифуги, работающие с охлаждением и в вакууме, – 500 000 g. Существуют два типа роторов – угловые и свободно подвешенные (бакет-роторы). Последние используются обычно в высокоскоростных центрифугах и ультрацентрифугах..

Скорость седементации частицы зависит от угловой скорости, эффективного радиуса ротора и седиментационных свойств частицы. Седиментационные свойства частицы характеризуются коэффициентом седиментации S и выражаются в единицах Сведберга, коэффициент седиментации может колебаться в широких пределах (от 5 для рРНК до 10⁷ для клеточных ядер).

g=ω²r v= ω²rS S=M(1-ūρ)/f,

где g – ускорение свободного падения (9,81 м/с²),

v – скорость седиментации, см/с,

ω – угловая скорость, рад/с,

S – коэффициент седиментации (1S=10^-13 с),

М – молекулярная масса,

ū – парциальный объем частицы, см³/г,

ρ – плотность раствора, г/см³,

f – коэффициент трения.

Наиболее часто ультрацентрифугированием определяют молекулярную массу белка. Исследуемый раствор белка помещают в небольшую прозрачную ячейку, которую вставляют в специальное гнездо ротора. Молекулы белка в этой ячейке под действием центробежной силы, развиваемой при вращении ротора, постепенно оседают на дно. Фотоприставка к ультрацентрифуге позволяет делать снимки содержимого ячейки через определенные промежутки времени и определять скорость оседания частиц. Определение молекулярной массы ведут двумя способами – по скорости седиментации белков и по седиментационному равновесию.

В первом случае измеряют скорость перемещения в ячейке ультрацентрифуги границы растворитель-белок, относя ее к величине развиваемого центробежного ускорения, то есть находят константу седиментации S=v/ω²r. Молекулярную массу белка рассчитывают по формуле M=RTS/D(1-ρ/σ), гдеR – газовая постоянная, T – температура, D – коэффициент диффузии, ρ – плотность растворителя, σ – плотность белковых частиц. Во втором случае измеряют концентрацию белка с₁ и с₂ в двух точках ячейки на расстоянии х₁ и х₂ от центра ротора в тот момент, когда после определенного срока работы ультрацентрифуги я ячейке установится седиментационное равновесие. Расчет ведут по формуле

M=2RT ln(c₂/c₁)/(1-ρ/σ)ω²(x₂²-x₁²).

При изопикническом центрифугированиипробу (ДНК, РНК или вирусы) равномерно распределяют во всем объеме раствора CsCl. Градиент плотности создается в процессе центрифугирования за счет седиментации и диффузии. Со временем каждая частица попадает в область, соответствующую ее собственной плавучей плотности. Центрифугирование прекращают, когда устанавливается равновесие. При использовании коротких кювет седиментационное равновесие достигается за несколько часов.

Кроме ультрацентрифугирования молекулярный вес белков определяют простой гель-фильтрацией. Определяют объем элюента, необходимого для выноса белка из колонки с гелем сефадекса V_e, и соотнесении его со свободным объемом колонки V_o. Пользуясь калибровочным графиком, построенным по V_e/V_o с использованием маркерного белка, находят молекулярную массу исследуемого белка.