Питательные среды.
Культивирование вирусов в культуре клеток .
Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц или других биологических объектов, способны размножаться вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде (`матрасы', флаконы, пробирки и др.). Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и злокачественно перерожденных тканей, обладающих более активной по сравнению с нормальными клетками взрослого организма способностью к росту и размножению. В зависимости от техники приготовления различают три вида культур клеток:
· однослойные - клетки, способные прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла лабораторной посуды в виде монослоя;
· суспензионные - клетки, размножающиеся во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании;
По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяются на:
· первичные, способные размножаться только на первых генерациях, т.е. в нескольких пассажах после выделения из тканей;
· перевиваемые, или стабильные, способные размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок посредством постоянного пассирования;
· полуперевиваемые, имеющие ограниченную продолжительность жизни (40 - 50 пассажей).
Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. При составлении питательных сред для клеточных структур приходится решать две трудно совместимые задачи. С одной стороны, необходимо воспроизвести среду максимально сходную со средой в которой клетки существуют in vivo, с другой стороны, чтобы создать контролируемые стандартные условия необходимо знать точный состав среды.
Натуральные, или естественные среды: полостные жидкости(амниотическая или аллантоисная жидкость, эмбриональный экстракт, тканевые экстракты плазма или сыворотка крови, ГЛА – гидролизат лактальбумина – продукт ферментативного гидролиза молока) позволяют решить только первую задачу. В средах же, приготовленных из очищенных строго определенных веществ лишь частично воспроизводятся естественные условия. Эти задачи легко решаются при кратковременном культивировании, когда основную роль играют такие факторы как осмотическое давление, pH, концентрация других неорганических ионов, буферная емкость, состав атмосферы. Осмотическое давление в клетке при 37°≈7,6 атм.
Изменения осмотического давления в пределах +-10% почти не влияют на состояние клеток и всетаки давление следует на нормальном уровне, что достигается добавлением Nacl, учетом других неорганических ионов и глюкозы. Получается, что если исходить из необходимости стабильного осмотического давления, легче изменить концентрацию белка, чем низкомолекулярных, особенно неорганических соединений.
Оптимум pH – 7,2 – 7,4 контролируется буферной системой, моделирующей буферную систему крови (NaHCO3 на слабом фосфатном буфере).
Для выживания клеток in vitro необходимы неорганические ионы Na, Ca, Mn, Fe, CO2, PO4, SO4. Роль их до конца не выяснена, но они необходимы для поддержания осмотического давления, прикрепления клеток к стеклу, активности ферментов. Поэтому основу любой питательной среды составляет сбалансированный по осмотическому давлению, pH и т.д. солевой раствор.
Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Эти растворы, как и фосфатносолевой буфер Дульбекко и Фогта используются также для орошения и промывки клеток при пассировании культур, выделении клеточных линий и других манипуляциях с культурами клеток.
Солевые растворы Эрла и Хэнкса с высокой буферной емкостью не менее 3 мл.(солевой раствор Хэнкса Ca Mg K Na - соли фосфорных, серных соляных кислот, D-glucose, phenol red.; Эрла - беднее) + сыворотки, амниотические жидкости, эмбриональные экстракты, дрожжевой экстракт. Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Для поддержания рН в большинстве сред используется бикарбонатный буфер: HCO3 = CO2 + OH, если выделяется углекислый газ, увеличивается концентрация ОН. Растворы могут содержать малое количество бикарбонатного буфера (раствор Хенкса), они предназначены для поддержания рН в плотно закрытых сосудах. В других (растворе Эрла) бикарбоната больше, они используются в системах с повышенным парциальным давлением СО2. Если культуры ведутся вне СО2инкубатора, где рН поддерживать труднее, необходимы альтернативные буферные системы. Хорошим буфером является HEPES 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислота. Индикаторы в питательные среды добавляются для того, чтобы контролировать кислотность среды в любой момент времени. Клетки в процессе роста подкисляют среду, и индикатор приобретает желто-оранжевое окрашивание.
Синтетические, стандартные среды: среда 199, среда Игла и ее модификации, среда RPMI1-1640, они содержат множество необходимых для развития клеток компонентов: аминокислоты (10 незаменимых а также цистин и тирозин, для многих клеток необходим глутамин), водорастворимые витамины, особенно, группы В, коферменты синтеза АТФ, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. Основа сред - растворы Эрла или Хэнкса. Используются как среды поддерживающие для первичных клеток и для культивирования лимфоцитов и кроветворных клеток.
Нормальные, сохраняющие специфические функции клетки на стандартных средах не размножаются (если не трансформированы). Для оптимального роста клеток обычно добавляют 5 - 20% фетальной (эмбриональной) сыворотки.
Сыворотка представляет собой чрезвычайно сложную смесь мелких и крупных молекул, способных как вызывать, так и тормозить рост клеток. К главным функциям сыворотки относятся: обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост клеток и их функции; обеспечение факторами прикрепления и распластывания клеток; обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т.д. Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторы роста.
Большинство ростовых факторов присутствуют в сыворотке в концентрации нескольких нанаграммов на миллилитр и ниже. Некоторые из этих факторов специфичны для клеток на определенной стадии дифференцировки, действие других не ограничено каким либо одним типом клеток. Один и тот же тип клеток может быть стимулирован различными ростовыми факторами. Например, фибробласты размножаются в ответ на фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса, фактор роста, синтезируемый тромбоцитами и соматомедины. Все эти вещества являются митогенами (стимулируют митоз). Другим важным фактором роста практически для всех типов клеток является гормон инсулин. Из других гормонов наиболее часто применяются глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон), стероиды (эстрадиол, тестостерон, прогестерон) и гормоны щитовидной железы (трииодтиронин). Гормоны стимулируют или подавляют рост в зависимости от типа клеток и их плотности. Глюкокортикоиды, например, влияют на пролиферацию клеток, изменяя их чувствительность к факторам роста.
Для переноса низкомолекулярных факторов (витаминов, аминокислот, липидов и других) необходимы транспортные белки. В этой роли выступает альбумин. Транспорт железа обеспечивает трансферрин, а поверхность большинства культивируемых клеток содержит рецепторы для этого белка. К факторам прикрепления и распластывания клеток относятся коллаген и фибронектин, более специализированы хондронектин (адгезия хондроцитов) и ламинин (адгезия эпителиальных клеток)