Экспрессия чужеродных генов

Трансформация протопластов изолированной ДНК

Впервые достоверная химическая трансформация растений была показана в опытах с двудольными. Их протопласты обрабатывали в присутствии полиэтиленгликоля выделенными Ti-плазмидами. После регенерации стенки клетки стали опухолевыми, а ДНК обнаружилась в ядрах, причем Т-ДНК оставалась в составе Ti-плазмид. Этот результат позволил приступить к созданию векторов, предназначенных для переноса генов в растения без использования агробактерий.

Структура таких векторов стандартна. Они содержат все необходимые элементы для манипулирования ими в клетках кишечной палочки, маркер для селекции растительных трансформантов и полилинкер. (рис.3.). Особенно важно отметить, что такие векторы можно использовать для трансформации протопластов как однодольных, так и двудольных растений. Их небольшой размер (несколько т.п.н.) позволяет достигать достаточно высокого уровня трансформации (10^-4 – 10^-2) при введении рекДНК в протопласты с помощью полиэтиленгликоля, липосом и методом электропорации. Апробирован также метод прямой микроинъекции рекДНК в ядра протопластов. Частоты трансформации при этом столь велики (5-25%), что отпадает необходимость в использовании селективных маркеров.

Однако и метод трансформации протопластов изолированной ДНК имеет свои ограничения. Далеко не у всех видов растений удается добиться регенерации клеток из протопластов, а у многих культурных видов регенерировавшие клетки не являются тотипотентными, поэтому из них нельзя восстановить растение.

Трансформация клеток и тканей изолированной ДНК.

Растительные клетки имеют прочную стенку, и пока единственным универсальным способом ее преодоления является обстрел растительных тканей ускоренными микрочастицами вольфрама, выдержанными в растворе векторной ДНК или РНК.

Основной недостаток таких методов – это непредсказуемый характер ее интеграции в клеточный геном. Разрывы, перекомбинации фрагментов происходят гораздо чаще, чем трансформация агробактериями.

Растениями воспринимаются как чужеродные в первую очередь гены, регуляторные сигналы которых (промоторы, сайты сплайсинга и полиаденилирования) они не узнают. Это достаточно серьезный барьер между одно- и двудольными.

Экспрессия чужеродных генов может изучаться на уровне клеток или целого растения. Исследования на клеточном уровне часто проводят только для тестирования создаваемых векторных конструкций, когда необходимо просто определить, есть ли экспрессия клонируемого гена, и какова ее эффективность. В таких случаях после трансформации клеток ограничиваются детектированием кратковременной экспрессии гена, не добиваясь получения стабильных трансформантов, у которых рекДНК интегрирована в клеточный геном.

На уровне целого организма при получении трансгенных растений возникает проблема тканеспецифической регуляции экспрессии клонированных генов. Известно, что тканеспецифичность экспрессии определяется набором регуляторных сайтов в предпромоторной области гена, с которым взаимодействуют транскрипционные факторы, а также энхансерами и сайленсерами, расположенными по обе стороны гена. Такие сигналы сохраняют свою функциональность при межвидовых переносах.

Регуляторные сайты идентифицируют с помощью присоединяемых к ним генов-репортеров. Так называют гены, чьи продукты определяются с помощью простых и чувствительных методов (колориметрия, флюорометрия, люминометрия, радиометрия) и чья активность в растительных клетках в норме отсутствует. Например, гены lux бактерий Vibrio harveyi и светлячка Photinus pyralis.