Люминесцентная микроскопия

Окраска мазков и препаратов люминесцирующими имму­ноглобулинами

На фиксированные и высушенные мазки и препараты с монослоем клеточной культуры наносят пасте­ровской пипеткой рабочую смесь специфического люминесци­рующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина. При окраске различными по специфичности люминесцирую­щими иммуноглобулинами мазков, расположенных на одном предметном стекле, нельзя допускать слияния капель конъюгатов.

Обработку мазков конъюгатами проводят во влажной ка­мере при температуре 37⁰С в течение 20 мин.

По истечении 20 мин стекла с мазками извлекают из влажной камеры, удаляют с поверхности мазков остатки конъюгатов и отмывают мазки для удаления непрореагиро­вавших люминесцирующих иммуноглобулинов.

Отмывку мазков проводят в двух сменах (по 5 мин каж­дая) 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 7,2-7,4) с 0,87% хлорида натрия, после чего мазки споласкивают ди­стиллированной водой.

Для получения правиль­ных результатов люминесцентной микроскопии необходимо до начала исследования тщательно сцентрировать всю осве­тительную систему микроскопа и подобрать опытным путем оптимальную комбинацию первичных и запирающих свето­фильтров. При использовании люминесцирующих иммуноглобулинов, меченных ФИТЦ, чаще всего применяют возбуж­дающие светофильтры СС-4, СС-8 или ФС-1, СЗС-7 в комби­нации с запирающим светофильтром типа ЖС-18.

При иммунолюминесцентном исследовании препаратов используют иммерсионные системы. При этом для выявления бактерий, риккетсий и грибов применяют масляную иммер­сию (нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметил­фталат). Для выявления вирусов в препаратах из клеточных культур или в мазках-отпечатках органов животных целесо­образно использовать водно-иммерсионные системы.

Нефлюоресцирующее масло (диметилфталат) наносят не­посредственно на мазок. При использовании водно-иммерси­онной системы на окрашенные препараты предварительно наносят трисглицериновую смесь, затем препарат накрыва­ют покровным стеклом, на которое сверху наносят каплю дистиллированной воды.

Для получения достоверных результатов исследования рекомендуется просматривать под микроскопом не менее 20-25 полей зрения в каждом мазке (если морфологически типичные возбудители встречаются почти в каждом поле зре­ния, можно ограничиться просмотром меньшего числа полей зрения).

Учет результатов иммунолюминесцентной микроскопии проводят визуально на основе выявления морфологических особенностей и локализации возбудителя, а также оценки ин­тенсивности и специфичности его свечения.

Оценку интенсивности специфической флюоресценции объекта проводят с учетом ее структурных особенностей по следующей схеме:

+ + + + - яркая сверкающая флюоресценция изумрудно-зеленого цвета, четко выявляются морфологи­ческие особенности микроорганизма, вокруг корпускулярных агентов может наблюдаться ярко светящийся ободок;

+ + + - яркая флюоресценция зеленого цвета, морфо­логические особенности микроорганизма выяв­ляются достаточно отчетливо, нередко хорошо видны периферические ободки;

+ + - слабая . флюоресценция желтовато-зеленого цвета, морфологические особенности микроор­ганизмов выявляются еще достаточно четко, периферические ободки почти не видны;

+ - очень слабая флюоресценция неопределенного цвета, микроорганизмы различаются с трудом;

- - флюоресценция объекта отсутствует.

Результаты иммунолюминесцентного анализа считаются положительными, если в препарате обнаруживаются, хотя бы единичные (для мелких бактерий и риккетсий - не менее 10 особей), морфологически типичные микроорганизмы или пораженные вирусом (риккетсиями, хламидиями) тканевые клетки (не менее 3-5 в препарате), специфически флюорес­цирующие на 3-4 креста при отрицательных контролях.

При исследовании любого неизвестного материала основ­ным контролем специфичности являются все остальные маз­ки данной пробы, которые оказались окрашенными гетеро­логичными по отношению к выявленному в пробе агенту лю­минесцирующими иммуноглобулинами. Наряду с этим имму­нолюминесцентный анализ должен сопровождаться микро­скопией и других препаратов, приготовленных из несодержа­щих микроорганизмы материалов (например, незараженные клеточные культуры, отпечатки органов здоровых животных и т.п.) и окрашенных теми же специфическими люминесци­рующими иммуноглобулинами. Этот контроль обязателен, прежде всего, при вирусологических исследованиях и может быть общим для всех проб на данный срок анализа.

При соблюдении всех необходимых условий приготовле­ния и окраски таких препаратов специфическая зеленая флю­оресценция во всех контрольных мазках должна полностью отсутствовать.

Анализ материалов пробы с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)

Для выявления содержащихся в пробе микроорганизмов, их антигенов и бактериальных токсинов применяют реакцию непрямой гемагглютинации с использованием иммуноглобу­линовых эритроцитарных диагностикумов.

Для постановки реакции необходимо иметь:

- эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум;

- иммунную сыворотку для контроля специфичности РНГА;

- изотонический раствор хлорида натрия;

- ингредиенты для приготовления разводящей жидкости (лошадиную или кроличью нормальную сыворотку).

Сухой эритроцитарный иммуноглобулиновый диагности­кум и гомологичный иммуноглобулин (иммунную сыворотку), а также ингредиенты для приготовления разводящей жидко­сти растворяют и подготавливают к реакции в точном соот­ветствии с наставлением по применению данного диагности­ческого препарата.

В зависимости от характера жидкой фазы пробы иссле­дуемый материал либо сразу используют в реакции, либо подвергают предварительной дополнительной обработке. В частности, в суспензии, приготовленные из органов и тка­ней животных, членистоногих, патологического материала, полученного от больных, а также в кровь и другие биологи­ческие жидкости добавляют равный объем насыщенного раствора хлорида натрия (для устранения возможных неспе­цифических реакций). С этой же целью культуральную сре­ду из пробирок с зараженной клеточной культурой разводят в два раза изотоническим раствором хлорида натрия. К про­бам воды добавляют 9% раствор хлорида натрия в соотно­шении 1 : 10.

Постановка реакции. Исследуемый материал разливают по 0,025 мл в два параллельных ряда лунок панели микротитрато­ра с таким расчетом, чтобы на каждый определяемый антиген приходилось по две лунки. Лунки первого ряда являются опытными, второго-контрольными. В лунки второго ряда для контроля специфичности реакции добавляют по 0,025 мл специфических иммуноглобулинов (иммунные сыворотки) соответствующих эритроцитарным диагностикумам. В лунки первого ряда (для уравновешивания объемов в опытных и контрольных лунках) вносят по 0,025 мл разводящей жидко­сти.

Содержимое лунок перемешивают путем легкого постуки­вания по углам панели.

Через 10 мин в первые лунки (опытную и контрольную) вносят по 0,025 мл 1 % взвеси соответствующего иммуногло­булинового эритроцитарного диагностикума. Панели после перемешивания содержимого в лунках оставляют стоять при комнатной температуре 1-1,5 ч до полного осаждения эри­троцитов.

Помимо контроля специфичности реакция сопровождается еще двумя контролями диагностикума:

- на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов (в две лунки вносят по 0,05 мл разводящей жидкости и по 0,025 мл 1% взвеси эритроцитарного диагностикума);

- на отсутствие неспецифической агглютинации эритро­цитов в иммунной сыворотке (в две лунки вносят по 0,025мл разводящей жидкости, 0,025 мл иммунной сыворотки и 0,025 мл 1% взвеси эритроцитарного диагностикума).

Учет реакции начинают с контролей. Характер осадков эритроцитов оценивают по 4-крестовой шкале:

++++ - агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме перевернутый купол;

+++ - по окружности равномерна агглютинировавших эритроцитов отмечается тонкое («фестон­чатое») кольцо;

++ - на фоне равномерно агглютинировавших эри­троцитов отмечается кольцо меньшего диамет­ра с более ровным краем;

+ - четкое кольцо малого диаметра на слабораз­личимом фоне агглютинировавших эритроци­тов;

- - агглютинация эритроцитов отсутствует, на дне лунки образуется маленькое кольцо с четким ровным краем или компактный диск.

Реакцию учитывают только при отсутствии гемагглютина­ции в контролях диагностикума. РНГА считают положитель­ной, если в лунках с исследуемым материалом имеется ге­магглютинация не менее чем на 3 креста при отсутствии та­ковой в тех лунках, куда был добавлен иммуноглобулин. РНГА считают отрицательной, если во всех лунках гемагглю­тинация отсутствует.

При наличии гемагглютинации как в опытной, так и конт­рольной лунке, реакцию следует повторить с разведением ис­следуемого материала 1:5 и 1:10. Если и в этом случае эритроциты также будут агглютинировать во всех лунках, реакцию считают неспецифической и ее результаты не учи­тывают.