Биологическое накопление риккетсий и хламидий

Биологическое накопление вирусов

Биологическое обогащение пробы в культуре клеток

Культуры клеток (линии: ВНК-21 - клетки почек одно­дневного сирийского хомячка; Verо-клетки почек африкан­ской зеленой мартышки; LLС-МК₂ - клетки почек макаки резус) используют для биологического накопления в пробе вирусов, риккетсий и хламидий. Учитывая биологические осо­бенности указанных групп возбудителей, исследование про­водят раздельно: в отношении вирусов и в отношении рик­кетсий и хламидий.

Материалом для заражения культуры клеток служит взвесь пробы из флакона «Д». Эта взвесь перед заражением клеток должна быть выдержана в холодильнике при 2-4⁰С не менее часа (контакт пробы с антибиотиками). Для выяв­ления большинства видов вирусов исследуемым материалом заражают 18 пробирок с монослоем клеток на пластинках.

Методика заражения клеточных культур состоит в сле­дующем:

- удаляют из пробирок с клеточной культурой ростовую среду;

- вносят в пробирки исследуемый материал (инокулят) в объеме 0,2мл;

- выдерживают пробирки в наклоненном положении в течение часа при комнатной температуре (контакт инокулята с клетками);

- полностью удаляют ипокулят из пробирок и однократ­но отмывают зараженные клетки 1,5 мл солевого раствора Хенкса или поддерживающей среды;

- вносят в пробирки по 1 мл поддерживающей среды. Пробирки с зараженной культурой клеток инкубируют а термостате при температуре 37⁰С в течение 44 (72)ч. Через 24 и 44 (72)ч из пробирок извлекают пластины с монослоем клеток для исследования с помощью МФА (по 9 пластинок на каждом сроке). Отмытые и высушенные пластины при­клеивают затем на три предметных стекла (по три пластины на каждом) и фиксируют в охлажденном ацетоне.

Остающаяся в пробирках после извлечения пластин куль­туральная жидкость может быть использована при необхо­димости для постановки РНГА.

Извлечение пластин с монослоем зараженных клеток про­водят с соблюдением правил асептики и требований проти­воэпидемического режима. Для извлечения пластин из про­бирок используют длинную пастеровскую пипетку, капилляр которой запаян и изогнут в виде короткого крючка. Извле­ченные из пробирок пластины однократно промывают изото­ническим раствором хлорида натрия и размещают в наклон­ном положении (клеточным слоем сверху) на листе фильтро­вальной бумаги, сложенной в виде «гармошки», и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания клеточ­ного слоя. Высохшие пластины приклеивают одним концом на предметное стекло клеем № 88.

После высыхания клея предметные стекла погружают в охлажденный химически чистый ацетон и фиксируют в нем в течение 15 мин при 2-4⁰С.

Материалом для заражения клеточных культур служит взвесь пробы из флакона «г». Эта взвесь перед заражением культуры клеток должна быть выдержана в холодильнике при 2-4⁰С не менее одного часа (контакт пробы с антибио­тиками).

Для выявления основных видов риккетсий и хламидий исследуемым материалом заражают 8 пробирок с монослоем клеток на пластинах. Для этого из пробирок с клеточной культурой удаляют ростовую среду, вносят в пробирки ис­следуемый материал (инокулят) в объеме 0,2мл, инкубиру­ют пробирки в наклонном положении в термостате при тем­пературе 37⁰С в течение 1,5-2 ч (контакт инокулята с клет­ками), полностью удаляют инокулят из пробирок и одно­кратно промывают зараженные клетки 1,5 мл «разводящей» среды. Вносят в пробирки по 1 мл поддерживающей среды с 2% сыворотки крупного рогатого скота без антибиотиков.

Пробирки с зараженной культурой клеток инкубируют в термостате при температуре 37⁰С в течение двух суток.

Через 24 и 44ч из пробирок извлекают пластины с моно­слоем клеток для исследования с помощью МФА (по 4 пла­стины на каждом сроке). Отмытые и высушенные пластины приклеивают на предметное стекло и фиксируют в охлаж­денном ацетоне.

Остающуюся в пробирках после извлечения пластин культуральную жидкость используют при необходимости для постановки РНГА.