Биологическое обогащение пробы в организме белых мышей

Постановка биопробы на ботулинический токсин

Биологическое обогащение проб на питательных средах

Концентрирование возбудителей в пробе физическими (иммуносорбционными) методами

Концентрирование в пробе возбудителей (бактерий, рик­кетсий) физическими методами проводят чаще всего путем фильтрования жидкой пробы через мембранные фильтры. Этот способ обогащения применяют в том случае, когда объ­ем доставленной пробы, превышает 50 мл. Для фильтрования используют мембранные фильтры № 3, предварительно про­кипяченные в дистиллированной воде.

Иммуносорбционное концентрирование в пробе БС мо­жет быть проведено при наличии в лаборатории соответст­вующих иммуносорбентов. Сортированные на иммуносорбен­те возбудители выявляются в дальнейшем с помощью МФА.

Для накопления содержащихся в пробе бактерий и пос­ледующего их исследования производят посев на питатель­ные среды:

- агар Хоттингера с генциановым фиолетовым и стиму­лятором роста чумного микроба или дрожжевой агар на ос­нове пептона Д с генциановым фиолетовым (.посев произво­дят на 2 чашки при температуре 37 и 28⁰ С);

- 2% мясопептонный агар Хоттингера с нанесенной па поверхность среды желточной эмульсией или дрожжевой агар на основе пептона Д с добавлением 0,2 мл 10% раствора фенолфталеинфосфата натрия (для исследования на возбу­дителя сибирской язвы);

- агар Хоттингера с 5% яичного желтка или агар на ос­нове пептона Д с цистином, глюкозой и дефибринированной кровью (для исследования на возбудителя туляремии);

- агар Хоттингера с 5% глицерина или дрожжевой агар с генциановым фиолетовым на основе пептона Д, 2% глице­рина и 1 % глюкозы (для исследования на возбудителя бру­целлеза );

- агар Хоттингера с 5% глицерина или дрожжевой агар на основе пептона Д с 5% глицерина, 10 ЕД/мл пенициллина и 25 ЕД/мл полимиксина (для исследования на возбудите­лей сапа и мелиоидоза).

Посев производят на предварительно подсушенные чашки Петри с питательными средами, шприцем наносят по 0,05 мл (1-2 капли) исследуемой взвеси. Нанесенный материал тща­тельно растирают по поверхности среды шпателем (одним для всех чашек данной пробы). Материалом каждой пробы засевают 6 чашек: 5 чашек с посевами помещают в термо­стат с температурой 37⁰С, одну чашку (с посевом для обна­ружения возбудителя чумы) инкубируют при температуре 28⁰С.

В процессе инкубации чашки с посевами просматривают через 12, 18, 24, 30, 36 и 44 ч.

При наличии подозрительного роста часть посева (отдель­ные колонии или «газон») снимают бактериологической пет­лей и готовят мазки на двух стеклах для исследования с по­мощью МФА. Одновременно с этим готовят также взвесь на стерильном изотоническом растворе хлорида натрия для ис­следования в РНГА.

Для накопления возбудителей системных микозов иссле­дуемый материал засевают на дрожжевой агар на основе пептона Д или элективную среду с антибиотиками. В зави­симости от концентрации клеток грибов в исследуемой пробе рост возбудителя в виде молодого мицелия может быть вы­явлен с помощью МФА через 2-3 сут.

 

Биопробу на ботулинический токсин ставят на белых мы­шах массой 16-18г. С этой целью двум мышам вводят внутрибрюшинно по 0,5мл нативного материала пробы из флакона «б». Контрольными животными в опыте служат че­тыре белых мыши, предназначенные для биологического обо­гащения пробы, которым исследуемый материал вводится в смеси с поливалентной противоботулинической сывороткой.

Для выявления признаков отравления животных ботули­ническим токсином (парез задних конечностей, «осиная та­лия» вследствие паралича диафрагмы, редкое дыхание) за ними устанавливают систематическое наблюдение в течение 44-48ч.

Для биологического обогащения содержащихся в пробе бактерий, риккетсий, хламидий, вирусов используют четы­рех белых мышей массой 16-18г, у которых предваритель­но ослаблена резистентность к инфекции. Последнее дости­гается путем внутримышечного введения в заднюю лапку 5 мг гидрокортизона (0,2мл ацетатной взвеси коммерческо­го препарата, содержащего 25мг гидрокортизона в 1 мл) за 4-5 ч до заражения животных исследуемым материалом.

Подготовленным таким образом белым мышам (4 мыши на пробу) вводят внутрибрюшинно по 1мл пробы с поли­валентной противоботулинической сывороткой (из флакона «в»).

За зараженными животными наблюдают в течение 44 ч. Павших мышей вскрывают немедленно, живых убивают эфи­ром в два срока: через 24 и 44 ч после заражения (по две мыши на срок).

Для исследования с помощью МФА у каждой вскрывае­мой мыши отрезают маленькие кусочки брюшины и селезен­ки и готовят ими мазки-отпечатки на пяти разграфленных на 8 квадратов предметных стеклах:

- на 1-м, 2-м, 3-м и 4-м стеклах - мазки-отпечатки брю­шины (верхний ряд квадратов) и мазки-отпечатки селезенки (нижний ряд квадратов);

- на 5-м стекле - только мазки-отпечатки селезенки (верхний и нижний ряды).

Всего таким образом от каждой мыши готовят по 16 от­печатков брюшины и 22 отпечатка селезенки.

Извлеченные из мышей селезенки помещают в стериль­ные пенициллиновые флаконы и хранят при температуре 2-4⁰С до конца исследования данной пробы.

При наличии в лаборатории мышей-сосунков их исполь­зуют для накопления содержащихся в пробе вирусов. Инфи­цирующим материалом служит взвесь пробы из флакона «д», которую вводят по 0,01 мл в мозг 1-2 - дневным мышам из одной семьи (для одной пробы используют 5-7 сосун­ков).

Вскрытие мышей производят через 24-44 ч. У каждого животного извлекают мозг и готовят из него мазки-отпечатки на 2-3 предметных стеклах. При необходимости из мозга готовят взвеси на изотоническом растворе хлорида натрия для исследования с помощью РНГА.