Окраска по Граму Ход окраски

Окраска метиленовым синим Лефлера Ход окраски

Окраска бактерий в мазках

Ход реакции

Приготовление реактивов

1. «Спирт-формалин» - фиксатор:

Смешивают 9 частей 96°этилового спирта (С₂Н₅ОН) и 1 часть 40% формалина.

Хранят в холодильнике.

2. 40° этиловый спирт:

Смешивают 100 мл этилового спирта (С₂Н₅ОН) и 144,4 мл дистиллированной воды

Хранят в холодильнике.

3. Инкубационная среда (готовят перед работой!):

40° С₂Н₅ОН - 5-7 мл;

3% Н₂О₂ - 2 капли;

бензидин - несколько кристаллов.

Реактивы смешивают, полученный раствор фильтруют.

1. Препарат фиксируют в смеси «спирт-формалин» 30 с.

2. Опускают на несколько секунд в эфир.

3. Оставляют в инкубационной среде (в темном месте) на 15 мин при 22°С.

4. Промывают водопроводной водой.

5. Высушивают.

Значение реакции.Наиболее важное значение имеет реакция в гематологических исследованиях, для определения формы лейкоза.

Наличие пероксидазы характерно для клеток миелоидного ряда, продукт реакции - желто-коричневого цвета. При миелобластном лейкозе продукт реакции в бластах определяется в виде гранул. При лимфобластном лейкозе - в виде крупных гранул. Реакция на перок-сидазу используется также для выявления продукта реакции антиген-антитело при проведении иммуноцитохимических реакций.

В цитологической практике нередко возникает необходимость в окраске и исследовании бактерий. Это чаще всего касается мазков из шейки матки и других органов и тканей, различного рода экссудатов. Мазки готовят разными способами. В тех случаях, когда материал жидкий, наносят его каплю на чистое предметное стекло и размазывают, пользуясь краем другого предметного стекла (лучше шлифованного). Если материал очень густой (например, гной), то его либо разводят физиологическим раствором и тогда поступают, как в первом случае, либо размазывают тонким слоем по предметному стеклу при помощи петли или стеклянной палочки. Наконец, можно готовить мазки-отпечатки, для чего чистое предметное стекло прикладывают непосредственно к серозному покрову, слизистой оболочке или к свежей поверхности разреза какого-либо органа (ткани). При наличии жидкого содержимого (экссудат, моча и пр.) его рекомендуют центрифугировать и из осадка готовить мазки.

Полученные по одному из вышеуказанных способов мазки тщательно высушивают и затем фиксируют сухим жаром. Фиксация достигается посредством несильного нагревания (примерно 70°C) предметного стекла, которое для этого трижды проводят над пламенем спиртовки мазком вверх. Можно фиксировать мазки и в 96° спирте (10-15 мин).

Фиксированные мазки сохраняются в течение какого угодно времени.

Окрашенные мазки исследуют с иммерсионным объективом. При желании заключают в бальзам: на окрашенный и хорошо высушенный мазок наносят каплю бальзама и помещают под покровное стекло.

1. Наливают на фиксированный мазок 0,1% водный раствор мети-ленового синего на 3-5 мин. Краску можно не фильтровать.

2. Сливают краситель и препарат основательно споласкивают в водопроводной воде.

3. Мазок просушивают фильтровальной бумагой.

1. Наливают на фиксированный мазок карболовый или анилиновый генциановый фиолетовый краситель (или кристаллический фиолетовый) на 2-3 мин.

Во избежание осадка окрашивают через фильтровальную бумагу.

Очень удобно работать с полосками фильтровальной бумаги, предварительно пропитанной 1% спиртовым раствором одного из вышеуказанных красителей и затем высушенной. Такую окрашенную и высушенную бумагу накладывают на мазок и смачивают дистиллированной водой. Продолжительность окрашивания остается прежней (2-3 мин).

2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу и быстро споласкивают в водопроводной воде (15-30 с).

3. Обрабатывают, наливая на мазок раствор Люголя, 1-2-3 мин.

4. Споласкивают в водопроводной воде (не обязательно).

5. Дифференцируют 96° спиртом, наливая и сливая его, пока не отойдет синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно 20-40-60 с). Во время дифференцировки препарат постоянно покачивают.

6. Хорошо споласкивают в воде.

7. Дополнительно окрашивают (для выявления грамотрицательных бактерий) либо 0,5% водным раствором нейтрального красного (нейтраль-рот), либо разведенным (в 10 раз) карбол-фуксином Циля (1-2-3 мин).

8. Промывают водопроводной водой и высушивают фильтровальной бумагой.

В результате грамположительные бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, прочие - в красный.

Следует заметить, что в классической прописи при окраске по Граму обычно не промывают мазки в воде ни после окраски генциа-новым фиолетовым (кристаллическим фиолетовым), ни после обработки раствором Люголя, ограничиваются только сливанием растворов. Цель предлагаемого промывания в воде - только чистота в работе, оно ни в какой мере не влияет на результаты окрашивания.