ОСНОВЫ ОРГАНИЗАЦИИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

 

Эффективность производства фармацевтической продукции биотехнологическими методами зависит от всех слагаемых и общего материального и энергетического баланса. При этом следует помнить, что в биотехнологии есть два активных представителя средств производства и между ними существует взаимовлияние. Действительно, чем выше темп функционирования биообъекта, тем более высокие требования предъявляются к аппаратурному оформлению процессов с его использованием. Необходима оптимизация как биообъекта, так и процессов и аппаратов биотехнологических производств.

Общая технологическая схема производства включает:

· подготовку посевного материала или инокулята, куда входит ряд этапов, начиная от засева пробирок и качалок колб до проведения выращивания в засевном ферментере;

· подготовку питательной среды для производственного ферментера, которая включает выбор и реализацию рецептуры среды, а также стерилизацию, гарантирующую сохранность всех пластических и энергетических компонентов в исходном количестве и качестве;

· подготовку ферментационного оборудования, гарантирующего сохранность от попадания в процесс контаминационной флоры;

· стадию биосинтеза, где в максимальной степени используются возможности биообъекта для получения лекарственного начала, которое накапливается внутри клетки или же секретируется в культуральную среду;

· стадию концентрирования, одновременно предназначенную и для удаления балласта;

· стадию очистки, реализуемую за счет повтора ряда однотипных операций или же за счет набора различных препаративных приемов повышения удельной специфической активности лекарственного начала (ультрафильтрация, экстракция, сорбция, кристаллизация);

· стадию получения конечной субстанции или готовой лекарственной формы с последующими операциями расфасовки и упаковки;

 

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ

Центральный этап фармацевтического производства – ферментация. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в питательную среду посевного материала (инокулята) до завершения процесса роста или биосинтеза биологически активных веществ. В основе процесса ферментации лежит культивирование продуцентов, т.е. выращивание культуры микроорганизмов, клеток высших растений или плесневых грибов.

Культура микроорганизмов – это популяция микроорганизмов, выращиваемая в питательной среде и находящаяся в стадии размножения или закончившая его. При производстве лекарств и БАД применяются следующие методы культивирования.

 

Методы культивирования

 

Поверхностное Глубинное

 

На жидких твердофазное непрерывное периодическое полунепре- питательных (2-3 см толщина рывное

средах слоя) с подпит- отъемно-

кой доливоч-

ное

 

с диализом

 

Твердофазная поверхностная ферментация осуществляется на увлажненной, сыпучей или пастообразной среде. Рост продуцента происходит на поверхности твердых частиц, а также в порах, заполненных водой или воздухом. Перемешивание не допускается, если культивируются микромицеты. Типичным примером является приготовление силоса или компоста в кучах. Управляемый процесс твердофазной ферментации имеет место при производстве ферментов с помощью микромицетов.

Для поверхностного культивирования на твердых средах применяют свекловичный или виноградный жом, зерновую шелуху, пшеничные или рисовые отруби, к которым добавляются различные питательные вещества. Оптимальная влажность субстрата 40-70%. Стерилизация осуществляется путем прямого введения пара в среду при перемешивании. Если увлажнение проводят подкисленными растворами, то стерилизация происходит 15-20 мин при 95 ºС. Обеспечение О2 затрудняется с увеличением слоя субстрата, поэтому для каждого штамма или производства своеобразная толщина слоя питательной среды. При выращивании мицелиальных грибов перемешивание не допускается. При твердофазной поверхностной ферментации очень большая проблема - поддержание постоянной температуры во всем объеме питательной среды. Например, температура компостов увеличивается от поверхности к глубинным слоям.

Кинетика роста популяции на поверхности (пленке) отличается от глубинных условий. При твердофазном культивировании в начале роста культуры, когда в среде отсутствует градиент концентрации субстрата, все клетки в колонии могут расти с максимальной для данной среды удельной скоростью роста, т.е. по экспоненциальному закону. В центральной части субстрата рост клеток лимитирован диффузией и, таким образом, биомасса растет с максимальной удельной скоростью лишь на поверхности питательной среды.

Управляемый процесс твердофазного поверхностного культивирования применяется при производстве энзиматических лекарственных препаратов.

Пример: производство амилолитических ферментов. В качестве питательной среды используют пшеничные отруби. Стерилизованную питательную среду после засева соответствующего штамма микромицета распределяют по кюветам и транспортируют в растильные камеры, где поддерживается определенная температура и влажность воздуха, а также обеспечивается вентиляция вдоль поверхности субстрата с целью аэрации.

Для Aspergillus awamori как продуцента амилаз различают 3 стадии выращивания культуры: 1) Рост до начала прорастания конидий (t - 32º - 38ºС, 100% влажность воздуха); 2) Стадия интенсивного прироста биомассы при t 27ºС; 3) На третьей стадии прекращают подачу в камеру кондиционированного воздуха. Общая продолжительность процесса 42 часа. Существенным недостатком этого метода является наличие больших производственных площадей, трудность автоматизации технологического процесса. В настоящее время разработаны типы механизированных растительных установок, которые в той или иной мере устраняют указанные недостатки кюветного способа. Применяют выращивание биомассы микромицетов на специальных лотках, установленных на движущемся транспортере, причем каждый лоток имеет специальный воздуховод и ворошитель.

Глубинная ферментация характеризуется присутствием клеток во взвешенном состоянии. В условиях лаборатории в колбы, объемом 50-250 наливают жидкую питательную среду, в которую засевают чистую культуру (из ампул или колбы), затем ее помещают на сутки в термостат с определенной температурой, где она растет и размножается. Аэробные продуценты выращивают в специальных колбах на качалках в термокамере. Вот этот пример является периодическим глубинным культивированием, т.е. рост продуцента осуществляется в закрытой системе (обмен газами, теплом), но питательная среда и посевной материал не вводятся в процессе роста продуцента.

При периодическом культивировании выделяют несколько фаз в развитии культуры.

1. Латентная фаза. Культура микроорганизмов осваивает питательную среду, заметного увеличения числа клеток не происходит. В этот период перестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, необходимые для использования новых субстратов, активируется биосинтез белка.

2. Фаза экспоненциального роста характеризуется быстрым накоплением биомассы и продуктов метаболизма. При этом запас питательных веществ в среде в оптимальной концентрации, увеличение числа клеток пропорционально времени, т.е. линейный рост культуры.

3. Фаза замедления роста – это непродолжительный период, в течение которого скорость роста культуры снижается, что связано с накоплением токсических продуктов метаболизма и расходованием питательных веществ среды.

4. Стационарная фаза – это скорость прироста биомассы полностью компенсируется скоростью гибели и лизиса клеток.

5. Фаза отмирания культуры – характеризуется полным истощением субстрата, накоплением веществ, ингибирующих рост, скорость прироста биомассы равно нулю.

При производстве лекарственных препаратов важную роль играет любая фаза. Так, при производстве первичных метаболитов важно сокращение до минимума латентной фазы и увеличение экспоненциальной фазы. Продолжительность латентной фазы зависит от состава питательной среды, возраста и массы инокулята. Перенос клеток из одной среды в другую, резкое изменение условий при масштабировании может оказывать на продуцент разностороннее воздействие. Системы контроля и регуляции ферментативной активности включают и адаптационные механизм, т.е., сталкиваясь с новыми питательными веществами, клетки начинают усваивать их только после синтеза ферментов.

Биотехнологически ценные продукты синтезируются в экспоненциальной фазе (нуклеотиды, ферменты, витамины – первичные метаболиты). В стационарной фазе и фазе отмирания синтезируются вторичные метаболиты - антибиотики, красящие вещества.

При непрерывном культивировании процесс постоянно протекает в экспоненциальной фазе, нет смены фаз развития культуры, как при периодическом культивировании (можно сравнить с оранжереей, где вегетация и плодоношение растений идет в течение всего года). Можно сказать, что при непрерывном культивировании жизнедеятельность культуры продлевается за счет постоянной подачи питательной среды и отбора культуральной жидкости, вместе с которой из реактора удаляются и токсические метаболиты.

Непрерывное культивирование может осуществляться в условиях крупнотоннажного производства в каскаде реакторов. Впервые данный метод был применен в 1915 году при производстве спирта в 1940 году – для получения ацетона.

Непрерывный процесс можно использовать в производстве БАВ, если культура при длительном выращивании не теряет способности к синтезу, т.е. генетически устойчива и однородна.

Для штамма Brechibacterium flavium 22 (производство лизина) экономическая эффективность при непрерывном режиме в 6 раз выше, чем при периодическом культивировании.

Характеризуя непрерывное культивирование, надо отметить, что высокая продуктивность процесса может быть достигнута при большем значении D (скорости разбавления), а это может быть связано с выносом неутилизированного субстрата. Поэтому данный метод далеко не всегда можно применять, например, в производстве антибиотиков и других препаратов медицинского назначения.

 

ПРИНЦИП И КОНСТРУКЦИИ БИОРЕАКТОРОВ.

В промышленном производстве фармацевтической продукции основной производительной силой является штамм-продуцент, поэтому стадия культивирования в специальных биореакторах или ферментерах является центральным этапом промышленного производства.

Принцип глубинного культивирования популяций микроорганизмов в аэробных условиях состоит в постоянном притоке в ферментационную среду источника О2 – воздуха при интенсивном перемешивании питательной среды. При проектировании ферментеров учитываются кинетические особенности популяции, а не отдельных клеток.

Конструкция биореакторов в промышленной биотехнологии должна учитывать процессы массопередачи, т.е. обмена веществ между различными фазами (между клеткой и жидкой питательной средой). Поэтому важной составной частью реактора является система перемешивания, служащая для обеспечения однородных условий в аппарате.

Перемешивание является одним из основных факторов, определяющих гидродинамическую обстановку в ферментере. С увеличением его интенсивности возрастают скорости массообмена и происходит равномерное распределение по всему объему питательных веществ, возрастает скорость биохимических реакций в клетках микроорганизмов вследствие отсутствия лимитирующих факторов. Однако, чрезмерное увеличение интенсивности перемешивания может быть связано с механическим воздействием на клетку.

При производстве лекарств биотехнологическими методами используют аэробные культуры. Поэтому конструкция реакторов предусматривает наличие узлов аэрирования с тем, чтобы обеспечить перенос О2 из газовой в жидкую среду и далее к клеткам в количествах, оптимальных для данного штамма в данной фазе роста.

Для аэрации культуральной среды используют воздух, или воздух, обогащенный О2, реже – кислород. В ходе метаболических процессов образуется СО2, подлежащий удале­нию.

Устройство ферментера

Ферментер представляет собой герметическую цилиндрическую емкость со сферической крышкой и днищем. Объем аппарата может быть от 0,01 до 100 м3. Лучший материал для изготовления ферментера – нержавеющая сталь.

 
 

Ферментер снабжен термостатирующим, перемешивающим и регулирующим рH среды устройствами, системой подачи питательной среды, пеногасителями воды и пара, змеевиком для стерилизации.

Рис. 1. Ферментер для выращивания микроорганизмов на газообразных углеводородах: 1 - корпус ферментера; 2 - охлаждающая рубашка; 3 - мешалка; 4 - привод мешалки; 5 - подача газообразных углеводородов; 6 - подача кислородсодержащего газа; 7 - подача жидкой , питательной смеси; 8 - подача посевной культуры; 9 - выход дрожжевой суспензии по окончании ферментации; 10 - выпуск газа из ферментера; 11 - выход газовой смеси на рециркуляцию; 12 - газоанализатор, подающий сигнал па регулирующее устройство клапана; 13 -регулятор давления внутри ферментера; 14 - улавливатель углекислого газа

Производственное культивирование проводят в стерильных условиях. Перед заполнением ферментера питательной средой его моют, проверяют на герметичность, стерилизуют. Одновременно стерилизуют весь трубопровод. Заполняют ферментер питательной средой на 70%, доводят рН среды и температуру до оптимальных параметров, характерных для микроорганизма-продуцента.

Стадия культивирования длится 48-72 часа. Имеются бактериальные культуры, стадия культивирования которых составляет 24 часа. Для грибов характерно культивирование 12 суток. На продолжении всего цикла растущую глубинную культуру необходимо снабжать кислородом. Обычно используют для этих целей барботажные устройства. При аэрации образуется пена, которая мешает процессу культивирования. Для ее погашения используют пеногасители - растительные и животные масла, силиконовые растворы или перемешивание культивируемой среды в верхнем слое.

По способу перемешивания и аэрации биореакторы подразделяются на аппараты с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием. Аппараты с механическим перемешиванием имеют механическую мешалку, состоящую из центрального вала и лопастей различной формы. Причем лопасти должны быть расположены в несколько этапов (для эффективного транспорта компонентов питательной среды непосредственно к клеткам). Аэрирующие устройства биореакторов барботажного типа имеют в нижней части реактора горизонтальную трубу с отверстиями, через которые разбрызгивают (барботируют) воздух в виде мелких пузырьков. Барботер снабжается механическим вибратором.

Ферментер с механическим перемешиванием барботажного типа

Это вертикальный аппарат цилиндрической формы объемом около 63 м3, изготовленный из высоколегированной стали Х18Н10 I с эллиптическими крышками и днищем. Н: Д = 2,6: 1. На крышках расположены приводы перемешивающего устройства, штуцеры для загрузки питательной среды и посевного материала, штуцер подачи и вывода воздуха, смотровые окна, люки для погружения моющей механической головки, штуцеры для приборов кипа. Внутри аппарата – вал с перемешивающим устройством, барботер, для подачи воздуха. Аппарат снабжен рубашкой из 6-8 ярусов-секций, площадь поверхности охлаждения 60 м2, t стерилизации 130-140 ºС, расход стерильного воздуха до 1 м3/мин. Высота столба жидкости 5-6 м, при pH = 8.

Ферментеры с пневматическим перемешиванием и аэрирование среды

В ферментерах пневматического типа механическая мешалка отсутствует. Переме­шивание жидкой питательной среды осуществляется пузырьками газа. Перемешивающим устройством является диффузор, выполненный в виде цилиндра, вмонтированный внутрь ферментера. Воздух под давлением поступает через отверстия в жидкость. Причем в месте ввода создается разряжение, и воздух поднимаясь снизу вверх, перемешивает культуральную жидкость. Коэффициент заполнения ферментеров с пневматическим перемешиванием на 10-15% ниже, чем с механическим. Аппараты рассчитаны для работы под избыточным давлением. Скорость массопередачи между газом и жидкостью в таких аппаратах ниже, чем с механическим перемешиванием и для преодоления этого недостатка вводятся различные модификации. Эрлифтный тип ферментера снабжен диффузором, причем через него проходит столб жидкой питательной среды, который расталкивается пузырьками воздуха, что способствует увеличению ее объема и жидкость перемешивается через верхний край диффузора вниз и это приводит к перемешиванию и аэрации жидкости в другом объеме аппарата, т.е. вне диффузора. В таких аппаратах практически нет угрозы избыточного пенообразования и коэффициент заполнения их выше.

Пневматические ферментеры характеризуются плановым перемешиванием и их можно применять при культивировании клеток высших растений и животных. Например, культура клеток Digitalis lanata образует в таком реакторе Р‑метилдиоксины (средство для лечения сердечно-сосудистой ишемии). Ферментеры с пневматическим перемешиванием привлекают также простотой конструкции и малыми энергозатратами, т.е. перемешивание и аэрирование совмещено в одном узле. Однако их нельзя применять в биотехнологических процессах для выращивания грибов и актиномицетов, выращиваемых на питательных средах с высокой вязкостью.

Ферментеры с циркуляционным перемешиванием

Эти аппараты содержат специальные устройства (насосы), создающие направленный поток жидкости по замкнутому кругу. Жидкость увлекает за собой пузырьки газа. Создан специальный ферментер с циркуляционным перемешиванием и наличием диффузора, т.е. сочетание циркуляционного перемешивания и пневматического.

 

ВОЗДУХОПОДГОТОВКА В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ

Очистку воздуха можно осуществить принципиально разными методами, основанными на уничтожении организмов или удалении их. Одним из самых эффективных способов стерилизации воздуха является облучение ультрафиолетовыми лучами. Этот метод используется для обеззараживания воздуха в боксах.

Отечественным и зарубежным опытом доказано, что технологически и экономически оправданным в промышленности является способ очистки воздуха с помощью волокнистых и пористых материалов. Таким путем удается получить воздух со степенью чистоты 99,9999%.

Для стерилизации воздуха рекомендуют также мембраны диаметром пор 0,45 мкм. Пористость мембран достигает 80%. Удаление микроорганизмов с помощью мембраны основано на ситовом эффекте. В основном фильтрующие материалы поставляет фирма "Миллипор" (США), в нашей стране (г. Владимир) налажен выпуск мембраны "Владипор". Мембранам не требуются высокие перепады давления, но для их надежной работы необходимо точное выполнение условий стерилизации. Стерилизовать мембраны можно только насыщенным водяным паром, от перегретого пара в мембранах появляются трещины, и мембраны выходят из строя.

 

ПОДГОТОВКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Биотехнологическое производство должно иметь продуцент, сырье для приготовления питательных сред, оборудование для всех этапов технологического процесса. Типичный элементарный состав микроорганизмов следующий: (в % к весу сухой биомассы) углерод – 50%, азот – 7-12% и микроэлементы. Все клетки содержат также кислород и водород. Среда для выращивания микроорганизмов должна включать элементы, которые входят в состав клеток, и сохранять правильное их соотношение.