Транскрипция
В процессе транскрипции происходит синтез цепи РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна последовательности одной из цепей ДНК. В результате транскрипции образуются 3 класса РНК. Во-первых, это матричная РНК (м-РНК), которая поступает в рибосомы и там направляет синтез одного или нескольких полипептидов, аминокислотная последовательность которых была закодирована геном или группой генов в хромосоме. Около 90-95% хромосомы E.coli кодирует м-РНК. Остальная часть хромосомы кодирует транспортные РНК (т-РНК) и рибосомные РНК (р-РНК), а также включает регуляторные последовательности, лидеры, спейсеры и хвостовые последовательности.
Между процессами репликации и транскрипции существует важное различие. В процессе репликации копируется вся хромосома и образуются дочерние ДНК, идентичные родительской ДНК. При транскрипции же не обязательно должна транскрибироваться всея клеточная ДНК. Напротив, обычно транскрибируются лишь отдельные гены или группы генов. Таким образом, процесс транскрипции ДНК протекает избирательно, он должен направляться особыми регуляторными последовательностями, указывающими начало и конец участков ДНК, подлежащих транскрипции.
Ф.Крик высказал предположение, ставшее частью центральной догмы молекулярной генетики, что РНК выполняет функцию переноса генетической информации от ДНК к рибосомам, где происходит биосинтез белка. Позже в 1961 г. Ф.Жакоб и Ж.Моно предложили название матричная РНК для той части клеточной РНК, которая переносит генетическую информацию от ДНК к рибосомам, т.е. к месту, где эти молекулы-переносчики служат матрицами для биосинтеза полипептидных цепей с определенной последовательностью аминокислот.
В растущих клетках E.coli присутствует сложная смесь сотен м-РНК, каждая из которых кодирует одну или несколько полипептидных цепей. Матричные РНК – это одноцепочечные молекулы самой разной длины. У прокариот одна молекула м-РНК может кодировать одну, две или даже большее число полипептидных цепей. Если она несет информацию только об одном полипептиде, то такая м-РНК называется моногенной, или моноцистронной. Если же она кодирует два или большее число разных полипептидов, то такую м-РНК называют полигенной, или полицистронной.
Минимальная длина мРНК определяется длиной полипептидной цепи, которую она кодирует. Например, для синтеза полипептидной цепи, содержащей 100 аминокислот, требуется мРНК из 300 нуклеотидов, т.к. каждая аминокислота кодируется тройкой нуклеотидов (триплетом). Однако образующиеся при бактериальной транскрипции мРНК всегда несколько длиннее, чем это необходимо для полепептида(ов), который они кодируют. Это объясняется тем, что мРНК содержит на 5 -конце некодирующий полинуклеотидный «лидер». Длина этих лидеров может составлять от 25 до 150 оснований. Полигенные мРНК могут также содержать нетранслируемые межгенные области, или спейсеры, которые разделяют участки, кодирующие отдельные полипептидные цепи, и, видимо, помогают регулировать скорость трансляции. Полигенные мРНК кодируют обычно 2 или большее число разных полипептидных цепей, функционирующих вместе, например, два или большее число ферментов, принимающих участие в одной и той же цепи метаболических реакций (например, в биосинтезе какой-нибудь аминокислоты) (рис. 15).
В 1959 г. был выделен из бактериальных экстрактов фермент, способный образовывать полимер РНК из рибонуклеозид- 5 -трифосфатов. Этот фермент, получивший название ДНК-зависимой-РНК-полимеразы, по ряду свойств похож на ДНК-зависимую ДНК полимеразу. РНК-полимеразе необходимы все 4 рибонуклеозид- 5 -трифосфата (ATP, GTP, UTP, CTP). В качестве предшественников нуклеотидных элементов РНК, а также ионы Mg2+. В активном центре фермента содержится цинк. РНК-полимераза удлиняет цепь РНК, присоединяя рибонуклеотидные мономеры к 3 -гидроксильному концу молекулы РНК, т.е. строит цепи РНК в направлении 5 → 3. Удлинение цепи РНК описывается уравнением:
Рис. 15 Схематическое изображение полигенной мРНК из прокариотических клеток: в данном случае мРНК представляет собой транкрипт трех генов; транскрипты генов разделены межгенными участками, или спейсерами.
РНК-полимераза требует для своего функционирования присутствия ДНК. Фермент наиболее активен, если в качестве матрицы используется природная двухцепочечная ДНК из того же самого или другого организма. Из двух цепей ДНК транскрибируется только одна. В места, соответствующие остаткам аденина ДНК-матрицы, в новосинтезированную РНК включаются остатки урацила, поскольку аденин и урацил образуют комплементарную пару. В места же, соответствующие тиминовым остаткам ДНК-матрицы, включаются остатки аденина. Остатки гуанина и цитозина в ДНК-матрице определяют включение соответственно цитозиновых и гуаниновых остатков в цепь РНК. Анализ нуклеотидного состава новообразованной РНК показал, что ее последовательность комплементарна последовательности матричной цепи. Хотя для работы РНК-полимеразы затравка не требуется, этот фермент не начинает функционировать до тех пор, пока не свяжется с особым участком матричной цепи ДНК, который служит сигналом инициации транскрипции. После связывания с этим участком фермент начинает синтез новой молекулы РНК; на ее 5 - конце обычно находится остаток GTP или ATP, чья 5 -трифосфатная группировка (обозначаемая ррр) не расщепляется до РРi, и остается без изменений на протяжении всего процесса транскрипции. В ходе транскрипции новосинтезируемая цепь РНК временно образует (за счет спаривания ее оснований с основаниями матричной цепи ДНК) короткие отрезки гибридной двойной спирали ДНК-РНК, которые необходимы для правильного считывания цепи ДНК. Гибридный дуплекс существует лишь непродолжительное время, поскольку вскоре после синтеза РНК «сходит» с ДНК (рис. 16).
Рис. 16 Этапы транскрипции ДНК
В E.coli присутствует только одна ДНК-зависимая РНК-полимераза, которая способна синтезировать не только мРНК, но также тРНК и рРНК. Она представляет собой большой (мол.масса 500 000) и сложный фермент, состоящий из пяти полипептидных субъединиц.
Первый этап транскрипции – это присоединение фермента к особому участку ДНК – промотору – короткой последовательности, узнаваемой РНК-полимеразой. РНК-полимераза занимает правильное положение в промоторном участке и образует несколько фосфодиэфирных связей, а затем шаг за шагом удлиняет молекулу РНК.
Об окончании транскрибируемого гена (генов) сигнализирует особая терминирующая последовательность в матрице ДНК. Для прекращения транскрипции и отделения РНК-полимеразы от ДНК необходим специфический ð-белок. Таким образом, синтез РНК включает три этапа: инициацию, элонгацию, терминацию (рис.16).
В эукариотических клетках присутствуют три ядерные РНК-полимеразы – I, II, III. РНК-полимераза I находится в ядрышке и участвует главным образом в биосинтезе рРНК, в то время как РНК-полимеразы II и III обнаруживаются в хроматине и нуклеоплазме. РНК-полимераза II осуществляет синтез мРНК, а РНК полимераза III отвечает за синтез тРНК и 5S-рРНК. Митохондрии, подобно бактериям, содержат только одну РНК-полимеразу. Удлинение цепи РНК с помощью эукариотических ДНК-зависимых РНК-полимераз происходит таким же образом, как и при участии фермента из E.coli; однако эти ферменты отличаются друг от друга по своей субъединичной структуре и по регуляторным элементам. Это естественно, поскольку эукариотические РНК-полимеразы должны транскрибировать ДНК, которая плотно упакована в нуклеосомы и связана с другими ядерными белками хроматина.