Репликация ДНК у прокариот

Полуконсервативный способ репликации

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК

Репликация ДНК – синтез ДНК – происходит по полуконсервативному механизму. Согласно гипотезе Уотсона-Крика, каждая из цепей двойной спирали ДНК служит матрицей для репликации комплементарных дочерних цепей. При этом образуются две дочерние двухцепочечные молекулы ДНК, идентичные родительской ДНК. Каждая из этих молекул содержит одну неизмененную цепь родительской ДНК и одну вновь синтезированную цепь дочерней ДНК.

Гипотеза Уотсона-Крика была проверена с помощью опытов, выполненных М.Мезельсоном и Ф.Сталем в 1957 г. Клетки E.coli выращивали в течение ряда поколений в среде, содержащей в качестве источника азота хлористый аммоний NH₄Cl, в котором обычный изотоп [¹⁴N] был заменен на «тяжелый» изотоп [¹⁵N]. Вследствие этого все соединения клеток, имеющие в своем составе азот, в том числе и азотистые основания ДНК, оказались обогащенными изотопом [¹⁵N]. Плотность ДНК, выделенной из этих клеток, была выше плотности нормальной [¹⁴N] ДНК. Смесь «тяжелой» [¹⁵N] и «легкой» [¹⁴N] ДНК удалось разделить методом центрифугирования в концентрированном растворе хлористого цезия. Поскольку [¹⁵N] ДНК чуть тяжелее, чем [¹⁴N] ДНК, полоса, в которой она достигает равновесия в градиенте СsCl, расположена ближе ко дну пробирки, чем полоса с [¹⁴N] ДНК (рис.7)

 

Рис. 7 Результаты эксперимента Мезельсона-Сталя

Мезельсон и Сталь перенесли клетки E.coli, росшие на среде с изотопом [¹⁵N] и содержащие «тяжелые» цепи ДНК, на свежую среду с обычным изотопом [¹⁴N]. На этой среде клетки E.coli выращивали в течение времени, необходимого для удвоения клеток. Затем из этих клеток выделяли ДНК и анализировали ее плотность с помощью описанного выше метода седиментации (осаждения ДНК в растворе СsCl). В градиенте СsCl была обнаружена лишь одна полоса ДНК, плотность которой оказалась средней между плотностью нормальной «легкой» [¹⁴N] ДНК и плотностью «тяжелой» [¹⁵N] ДНК (рис. ). Это подтвердило, что двухцепочечная ДНК дочерних клеток содержит одну старую ¹⁵N – цепь от родительской ДНК и одну новую ¹⁴N – цепь.

Если выделить ДНК из клеток, которые прошли два цикла удвоения на среде с [¹⁴N], то она разделится на две полосы: одна с плотностью, соответствующей плотности нормальной «легкой» ДНК, а другая с плотностью «гибридной» ДНК, наблюдавшейся после первого удвоения клеток. На основании этих данных Мезельсон и Сталь пришли к выводу, что в строгом соответствии с гипотезой Уотсона-Крика каждый дочерний дуплекс ДНК после двух циклов удвоения клеток содержал одну родительскую и одну новообразованную цепь ДНК. Такой механизм репликации назвали полуконсервативным. Полученные результаты полностью исключили консервативный способ репликации, при котором одна дочерняя ДНК должна была бы содержать обе исходные цепи, а другая состояла бы из двух новосинтезированных цепей. Опыт Мезельсон и Сталя позволил также отвергнуть дисперсивный механизм репликации, при котором каждая дочерняя цепь ДНК состоит из коротких участков как родительской, так и новообразованнй ДНК, соединенных между собой случайным образом.

ДНК бактерий и многих ДНК-содержащих вирусов представляет собой кольцевую двойную спираль. Эксперименты, выполненные Д.Кэрнсом, показали, что ДНК в клетках E.coli реплицируется, оставаясь в кольцевой форме. Первоначально считали, что репликация начинается в фиксированной точке родительской ДНК (точке начала репликации) и что единственная репликативная вилка движется по кольцевой молекуле ДНК в одном направлении (рис. 8).

Однако последующие эксперименты, проведенные на хромосомах E.coli и вирусов, показали, что репликация обычно происходит в двух направлениях, т.е. существует две репликативные вилки. Обе вилки возникают в одной точке и удаляются от нее в обоих направлениях одновременно, пока снова не встретятся. В этой точке два полностью синтезированных дочерних двухцепочечных кольца разделяются: каждое из них содержит одну старую и одну новую цепь.

Участок начала репликации представляет собой нуклеотидную последовательность длиной 100-200 пар оснований. Эта последовательность узнается специфическими клеточными белками, которые начинают в этом месте цикл репликации.

 

Рис. 8 Репликация хромосомы E.coli. А – схематическое изображение хромосомы E.coli в ходе репликации, Б – процесс репликации хромосомы E.coli