Лекция 10. Генетический анализ. Рекомбинация генетического материала у бактерий.
По определению А.С.Серебровского: «Генетическим анализом мы называем систему опытов, наблюдений и вычислений, имеющих целью разложение свойств (признаков) организма на отдельные наследственные элементы и изучение свойств соответствующим им генов».
Этапы генетического анализа:
1. наследуется ли признак, имеет ли он контрастные формы;
2. какое число генов контролирует развитие данного признака;
3. есть ли взаимодействие между генами;
4. определение групп сцепления и картирование генов;
5. определение характеристик генов;
6. клонирование гена;
7. определение последовательности нуклеотидов ДНК (секвенирование);
8. выяснение экзон-интронной структуры гена;
9. определение времени его экспрессии в онтогенезе.
Картирование генов на хромосомах:
- получение спонтанных и индуцированных мутаций;
- тестирование мутаций на аллелизм;
- картирование гена в группе сцепления;
- построение кроссоверных карт генов;
- картирование генов с помощью хромосомных перестроек;
- картирование генов с помощью гибридизации in situ;
- использование моносомиков и нуллисомиков;
- использование гибридизации клеток в культуре in vitro.
Генеалогический и близнецовый методы при определении характера наследования генов у человека.
Генетический анализ у бактерий
У бактерий найдено три механизма объединения и рекомбинации генетического материала: трансформация, конъюгация и трансдукция.
Конъюгацией называется непосредственный контакт между клетками бактерий, сопровождаемый однонаправленным переносом генетического материала из клетки донора в клетку реципиента. Процесс конъюгации у бактерий (кишечной палочки) был открыт в 1946 г. Дж. Ледербергом и Е.Тэйтумом. Они взяли два штамма бактерий, маркированные мутациями ауксотрофности. Первый штамм нуждался в треонине, лейцине и тиамине, а второй – в биотине и метионине. На минимальной среде без этих компонентов клетки не росли. Частота обратных мутаций по трем генам составляла не более 10-21. Эти штаммы смешали в полной среде и после инкубации в течение 24 часов высеяли на минимальную среду. Прототрофные колонии появлялись с частотой 10-7, следовательно, имело место взаимодействие бактерий двух штаммов.
Для появления прототрофных колоний необходим был контакт между клетками двух штаммов. Если бактерий помещали в U-образную трубку, разделенную мембраной, через которую могли проходить молекулы, но не клетки, на минимальной среде ничего не вырастало.
Позднее с помощью электронной микроскопии были получены фотографии конъюгирующих бактерий, соединенных мостиком-пилем. Эти данные свидетельствовали о том, что кишечная палочка имеет определенный тип скрещивания, когда генетический материал может передаваться между клетками, временно находящимися в контакте.
Исследуемые штаммы кишечной палочки разделились на две группы: в первой конъюгации не было, во второй она происходила в 100-1000 раз реже, чем между группами. Их стали рассматривать в качестве двух половых типов: F- (первая группа) и F+ (вторая группа). Было показано, что при конъюгации клеток происходит односторонняяпередача генетического материала от F+ к F-, клетки F- после конъюгации приобретают характеристики F+.
F-фактор находится в плазмиде – маленькой кольцевой ДНК, способной к автономной репликации. При конъюгации F-фактор переходит из донорной клетки в реципиентную по F пилю. В F-плазмиде идентифицировано около 20 генов, контролирующих различные этапы конъюгации, большая их часть объединена в один оперон.
Позже был выявлен третий половой тип – Hfr(high frequency recombination), определяющий высокую частоту рекомбинации. У бактерий этого типа F-плазмида интегрирована в хромосомную ДНК. При конъюгации интегрированный F-фактор не только переходит сам в реципиентную клетку, но и перетаскивает часть бактериальной хромосомы. Внесенная ДНК рекомбинирует с ДНК реципиентной клетки, возникает новая комбинация генов.
Полный перенос ДНК из донорной клетки в реципиентную с помощью F-плазмиды занимает примерно 1 час. Процесс конъюгации может быть прерван в любой момент простым встряхиванием пробирки. По времени перехода генов из одной клетки в другую можно судить об их расположении в бактериальной хромосоме.
F-плазмида может как интегрироваться в бактериальную хромосому, так и выйти из нее и продолжить существование в виде плазмиды. Иногда вырезание бывает неточным, и участок бактериальной хромосомы замещает участок F-фактора. Образуется так называемый F’-фактор, он переносит попавшие в него гены хромосомы в клетку-реципиент. В результате в последней появляются два аллеля одного гена. Это явление называется сексдукцией.
Трансформация бактерий это перенос ДНК, изолированной из одних клеток в другие. Для того, чтобы ДНК проникла в бактериальные клетки, они должны находиться в состоянии компетентности. Возникновению компетентности, приобретаемой лишь частью клеток культуры обычно в середине логарифмической фазы роста, способствует особый белок, который вырабатывается в ходе роста культуры. Сначала ДНК связывается с поверхностью компетентных клеток, расщепляется специальными нуклеазами до фрагментов определенной величины. После этого фрагменты ДНК проникают в клетку. Некоторые бактерии, например, пневмококки, могут неспецифически поглощать ДНК из разных организмов. Другие бактерии, например, гемофилус, поглощает только ДНК своего вида. Весь процесс трансформации завершается за 10-30 минут, частота трансформации может достигать 1%. Попав в клетку, фрагмент ДНК рекомбинирует с ДНК бактериальной хромосомы. Введение в клетку ДНК в процессе трансформации можно отследить по появлению у бактерии-реципиента новых признаков, которые контролируются введенной ДНК.
Трансформация используется для генетического картирования у бактерий. При трансформации в хромосому реципиента встраивается сравнительно небольшой фрагмент ДНК. Если два гена находятся на хромосоме далеко друг от друга, они не могут оказаться в одном фрагменте трансформирующей ДНК. Одновременная трансформация (котрансформация) двумя независимыми фрагментами, содержащими эти гены, - событие крайне маловероятное. Таким образом, частота котрансформации двух генов служит показателем расстояния между ними.
Трансдукцией называют перенос генов из одних бактериальных клеток в другие при помощи бактериофага.
Бактериофаги делятся на две категории: вирулентные и умеренные. Вирулентный фаг, проникнув в клетку, вызывает литическую реакцию, то есть размножается и лизирует бактерию. Умеренные фаги могут вызвать как литическую, так и лизогеннуюреакцию. В последнем случае инфицирующий фаг встраивается в ДНК бактерии, превращаясь в профаг. В лизогенных культурах может происходить индукция бактериофага, в результате чего происходит массовый лизис бактерий. Это явление происходит спонтанно и стимулируется агентами, повреждающими ДНК.
При выходе профага из ДНК бактерии он захватывает участки бактериальной ДНК. При последующем заражении другой клетки при условии лизогенной реакции эти гены переносятся в новый геном. Если фаг интегрирует в любые участки бактериального генома и, соответственно, переносит любые участки бактериальной ДНК, говорят об общей, или неспецифической трансдукции. Встраивание фага в определенные участки бактериального генома – специфическая трансдукция.Перенесенный ген может наследоваться стабильно, поскольку он интегрирован в хромосому бактерии-реципиента. Это полная трансдукция. В других случаях, при абортивной трансдукции, внесенный фагом фрагмент генома не реплицируется и передается только одной из дочерних клеток. Абортивная трансдукция происходит чаще, чем полная, в 10 раз.
Бактерия-донор через фаг передает реципиенту лишь отдельный фрагмент ДНК длиной 1/50 – 1/100 от всей бактериальной хромосомы. Обнаружение котрансдуцируемости двух или более генетических маркеров указывает на их сцепленность, а по частоте такой котрансдукции можно судить о порядке расположения генов на генетической карте. Например, если маркеры a+ и b+, а также b+ и c+ трансдуцируются попарно, а маркеры a+ и c+ не трансдуцируются, следовательно они локализованы в порядке a – b – c.