Световая микроскопия

Методы цитологии

 

Один из основных методов, который широко используется в цитологии. Световой микроскоп представляет собой оптическую систему, состоящую из конденсора, объектива. Пучок света от источника освещения собирается в конденсоре и направляется на объек. Пройдя через объект, лучи света попадают в систему линз объектива; они строят первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, - объектив. В современных микроскопах объективы сменные, что позволяет изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность. Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например, путем проекции на экран (до 10⁵ раз).

Разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно, зависит от длины волны – чем она меньше, тем меньшего размера деталь мы можем увидеть, и от нумерической апертуры объектива (n sin a) – чем она выше, тем выше разрешение. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать ультрафиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13-0,14 мкм). Это является пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света.

Таким образом, все, что может дать световой микроскоп - это повысить разрешающую способность нашего глаза примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую способность около 0,1 мм, что равно 100 мкм). Следовательно, минимальным расстоянием между двумя точками видимых глазом в микроскоп являются 0,2-0,3 мкм.

Однако в световом микроскопе удается видеть частицы меньшей величины, чем 0,2 мкм. Это метод «темного поля». Суть его заключается в том, что в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод применяется при изучении живых клеток.

Метод фазово-контрастной микроскопии.Широко используется для наблюдений за живыми клетками и основан на том, что отдельные участки в целом прозрачной клетки мало, но отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз, чувствительный только к изменению интенсивности света, не улавливает. В фазово-контрастном микроскопе в объективе имеется специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.

Метод интерференционной микроскопии. В интерференционном микроскопе пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект и приобретает изменения в фазе колебания, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, отличаются друг от друга по степени контрастности. Измеряя сдвиги фаз, определяют концентрацию и массу сухого вещества в объекте.

Метод поляризационной микроскопии. С ег помощью изучают объекты, обладающие так называемой изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц. У такого микроскопа перед конденсором помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который пропускает свет с этой же плоскостью поляризации. Поляризатор и анализатор – это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя). При повороте анализатора на 90^о по отношению к поляризатору свет не проходит. Если между такими скрещенными призмами поместить объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле.