Синтез белков и нуклеотидов.
Синтез белков представляет собой биохимический механизм образования полипептидов, аминокислотные последовательности которых закодированы в виде последовательности кодонов в соответствующей mРНК. Однако в процессе синтеза полипептидов кодоны и протеиногенные аминокислоты вступают в непосредственное взаимодействие друг с другом. Роль посредников между ними выполняют тРНК и ферментные системы, катализирующие правильное связывание аминокислот с соответствующими тРНК, а также образование способных к синтезу белков рибосом и связывание их с mРНК. В связи с тем, что процесс синтеза белков включает перевод генетической информации, закодированной в виде последовательности кодонов в молекулах mРНК, в последовательность аминокислотных остатков в белковых полипептидах, его называют трансляцией.
Синтез полипептидов начинается с активирования аминокислот и их ковалентного связывания с соответствующими тРНК, которое катализируют ферменты аминоацил-тРНК-синтетазы. Для каждой аминокислоты существует свой фермент, который с высокой точностью катализирует присоединение конкретной аминокислоты к соответствующей тРНК. На первом этапе фермент катализирует взаимодействие аминокислоты с АТФ, в результате образуется аденилат аминокислоты, содержащий макроэргическую связь, и пирофосфат:
О О
// //
R-СН-С + АТФ ¾® R-СН-С + Н4Р2О7
| \ | \
NH2 ОН NH2 О~ АМФ
аминокислота аденилат аминокислоты
На следующем этапе осуществляется перенос радикала активированной аминокислоты на 3'-конец тРНК, имеющий последовательность из трёх нуклеотидных остатков ЦЦА со со свободным 3'-ОН. В ходе такой реакции происходит соединение макроэргической связью остатка аминокислоты с соответствующей тРНК, а фермент и адениловая кислота высвобождаются:
|
Следует отметить, что промежуточный продукт–аденилат аминокислоты–взаимодействует с тРНК, не выходя из ферментного комплекса, который, кроме каталитической, выполняет ещё две функции: контролирующую и корректирующую. При синтезе аминоацил-тРНК фермент точно выбирает и присоединяет к соответствующим акцепторным участкам определённую аминокислоту и определённую тРНК. Контролирующая функция аминоацил-тРНК-синтетазы заключается в том, что фермент распознает правильность присоединения к аденилату аминокислоты соответствующей тРНК. И если в ходе реакции произошла ошибка, то аминоацил-тРНК-синтетаза, соответствующая данной тРНК, подвергает гидролизу образовавшееся соединение.
Корректирующая функция связана с проверкой ферментом правильного подбора аминокислоты для соединения с определённой тРНК. В случае присоединения к молекуле тРНК неправильной аминокислоты образовавшаяся аминоацил-тРНК также подвергается гидролизу. В результате точной работы фермента, активирующего аминокислоты, вероятность неправильного соединения аминокислоты с тРНК очень мала, она обычно не превышает 0,00006.
Следующий этап синтеза белков, называемый инициацией синтеза полипептидной цепи, происходит с участием рибосом, зрелой mРНК, специфических белковых факторов и инициаторной аминоацил-тРНК. В результате их взаимодействия образуется инициаторный комплекс, в котором осуществляется соединение mРНК с рибосомой и инициаторной аминоацил-тРНК.
Рибосомы – это нуклепротеидные частицы, в которых молекулы рибосомных РНК образуют комплексы с набором специфических рибосомных белков (55 у бактерий и около 70 у эукариот), многие из которых обладают основными свойствами, так как содержат большое количество остатков лизина и аргинина. Диаметр бактериальных рибосом обычно составляет 22 нм, длина около 30 нм. Размеры рибосом цитоплазмы эукариотических клеток превышают размеры бактериальных рибосом в среднем в 1,17 раза. Однако чаще всего размеры рибосом выражают в единицах Сведберга (S) по скорости седиментации частиц в процессе ультрацентрифугирования.
Бактериальные 60S-рибосомы состоят из двух субъединиц – малой 30S-субъединицы и большой 50S-субъединицы. В цитоплазме клеток высших организмов содержатся соответственно 80S-рибосомы, которые распадаются на 40S и 60S-субъединицы. В хлоропластах и митохондриях клеток высших организмов имеются свои собственные рибосомы, которые по химическому составу и размерам находятся ближе к рибосомам прокариот.
Инициация синтеза полипептидной цепи всегда начинается с участием особой метионил-тРНКi, которая с помощью водородных связей комплементарно присоединяется своим антикодоном УАЦ к кодону АУГ mРНК, называемому в связи с этим инициаторным кодоном. Таким образом, синтез любой полипептидной цепи начинается с включения в неё на N-конце остатка аминокислоты метионина, однако после того как синтез полипептида осуществляется, его молекула может подвергаться так называемой посттрасляционной модификации, в ходе которой концевые фрагменты молекулы полипептида могут отщепляться специфической протеазой, поэтому функционально активные полипептиды не всегда содержат на N-конце остатки метионина. С меньшей частотой в качестве инициаторного кодона может использоваться триплет ГУГ, к которому также присоединяется метионил-тРНКi.
У бактерий к инициаторному кодону присоединяется N-
|
Однако вскоре после начала синтеза полипептидной цепи формильная группировка отщепляется. В отличие от аминоацил-тРНКi, участвующей в инициации синтеза полипептидной цепи, перенос остатков метионина в процессе дальнейшего синтеза полипептидной цепи осуществляется метионил-тРНК второго типа, которая не может взаимодействовать с инициаторным кодоном.
Образование инициаторного комплекса катализируют специфические белки, называемые белковыми факторами инициации синтеза полипептидной цепи. У бактерий это белковые факторы IF1, IF2, IF3, у растений и животных – IF-М1, IF-М2, IF-М3. Наиболее хорошо генетическая система синтеза белков изучена у бактерий.
В бактериальной клетке инициация синтеза белков начинается с того, что белок IF3 связывается с малой субъединицей рибосомы (рис. 51), предотвращая её соединение с большой субъединицей. Затем происходит присоединение малой рибосомной субъединицы к участку на m-РНК, содержащему инициаторный кодон. После этого оказывается возможным комплементарное присоединение к инициаторному кодону N-формил-тРНКi с участием белковых факторов IF2, IF1 и образование так называемого инициаторного комплекса. При этом белок IF2 содержит в связанном состоянии ГТФ, который в дальнейшем подвергается гидролизу в процессе присоединения к инициаторному комплексу большой субъединицы рибосомы, а высвобождающаяся при гидролизе энергия используется для формирования комплекса рибосомы, mРНК и присоединённой к mРНК метионил-тРНКi. Образовавшийся комплекс способен в дальнейшем участвовать в следующем этапе синтеза белка – элонгации полипептидной цепи), а белковые факторы IF3, IF1 и IF2 высвобождаются.
В клетках высших организмов порядок формирования инициаторного комплекса несколько отличается – с малой субъединицей рибосомы вначале связываются метионил-тРНКi, а затем уже к рибосоме присоединяется молекула mРНК.
| |
Второй этап элонгации полипептидной цепи заключается в образовании пептидной связи между аминокислотными остатками метионина и другой аминокислоты, присоединённой через антикодон тРНК к следующему кодону mРНК. Направление размещения кодонов в mРНК происходит от 5'-конца к 3'-концу, а направление образования пептидных связей в синтезирующемся пептиде от N-конца к С-концу. Образование пептидной связи катализирует фермент пептидилтрансфераза, которая входит в состав большой субъединицы рибосомы. Энергия, необходимая для синтеза полипептидной связи, высвобождается в результате расщепления макроэргической связи между остатком аминокислоты и тРНК. Образование пептидной связи под действием пептидилтрансферазы можно записать в виде следующей реакции:
|
Третий этап процесса элонгации полипептилной цепи получил название транслокации. Этот этап катализирует белковый фактор IF2 в комплексе с ГТФ, под действием которого рибосома перемещается вдоль молекулы mРНК в направлении от 5' к 3'-концу на три нуклеотидных остатка, включая в сферу реакции присоединения аминоацил-тРНК следующий кодон. В ходе этой реакции, которая сопровождается гидролизом ГТФ, происходит высвобождение белкового фактора IF2 и выход из рибосомы тРНКi, а синтезированный дипептид остаётся связанным с тРНК2, присоединённой водородными связями к своему кодону в составе mРНК.
После этого уже к третьему кодону может присоединиться соответствующая тРНК, связанная со своим аминокислотным остатком, который соединяется новой пептидной связью с синтезированным дипептидом. Затем повторяется акт транслокации и рибосома снова перемещается на один кодон, к которому может уже присоединиться с помощью тРНК следующий аминокислотный остаток и т.д., пока не будет синтезирована полностью полипептидная цепь, закодированная в виде последовательности кодонов в структуре mРНК. При этом последовательность соединения аминокислотных остатков в синтезированной полипептидной цепи будет определяться последовательностью кодонов в mРНК-матрице.
По мере продвижения рибосомы вдоль молекулы mРНК в ходе синтеза полипептидной цепи происходит высвобождение её конца, содержащего инициаторный кодон. И на нём начинается образование нового инициаторного комплекса и активной рибосомы, которая будет осуществлять синтез новой полипептидной цепи на одной и той же mРНК-матрице. В результате одновременного взаимодействия с одной и той же молекулой mРНК нескольких рибосом образуется полирибосома. В зависимости от линейных размеров mРНК полирибосома может включать от 3-5 до нескольких десятков рибосом. За счёт образования полирибосом значительно повышается эффективность использования клеткой mРНК, так как на одной молекуле mРНК с помощью присоединённых к ней рибосом одновременно может синтезироваться несколько полипептидных цепей (по числу рибосом в полирибосоме).
Синтез полипептидной цепи продолжается до тех пор, пока на пути движения рибосомы по mРНК не встретится терминирующий кодон. Как было указано ранее (табл. 14), имеются три терминирующих кодона – УАГ, УГА и УАА. Они не кодируют аминокислотные остатки, но служат сигналами для прекращения синтеза полипептидной цепи. Эти кодоны способны узнавать специфические белки, называемые факторами терминации: у бактерий существуют два таких белковых фактора –RF1 и RF2, у высших организмов – один (RF- по-английски release factor).
Когда терминирующий кодон оказывается в составе рибосомы, с ним связывается белковый фактор терминации (рис. 53), который катализирует гидролитическое расщепление сложноэфирной связи, соединяющей синтезированную полипептидную цепь с последней тРНК, комплементарно связанной своим антикодоном с соответствующим кодоном mРНК. В результате гидролиза этой связи синтезированный полипептид отделяется от рибосомы, а освобожденный от полипептидной цепи рибосомный комплекс диссоциирует с образованием свободных субъединиц рибосомы, mРНК, свободных белковых факторов терминации трансляции и оставшейся последней молекулы тРНК, от которой была отделена синтезированная полипептидная цепь. В дальнейшем они могут снова принять участие в синтезе новой молекулы белкового полипептида.
После отделения синтезированной полипептидной цепи от рибосомы она приобретает свойственную ей пространственную структуру в соответствии с последовательностью соединения в ней аминокислотных остатков. Образовавшиеся в процессе трансляции полипептиды под действием соответствующих ферментов подвергаются посттрансляционному процессингу, в ходе которого они превращаются в функционально активные белки, имеющие характерную для них нативную конформацию молекул.
В результате процессинга от белковых полипептидов специфическими протеазами могут отщепляться концевые фрагменты их полипептидных цепей. Возможна также модификация аминокислотных радикалов (например, превращение остатков пролина в остатки оксипролина), образование дисульфидных связей, фосфорилирование остатков серина или тирозина и др. В связи с тем, что процесс трансляции осуществляет довольно сложный по структуре нуклеопротеидный комплекс, скорость синтеза полипептидной цепи существенно ниже, чем скорость образования молекул нуклеиновых кислот. В клетках бактерий с участием функционально активных рибосом за 1 мин может синтезироваться полипептидная цепь, включающая 300-400 аминокислотных остатков, а у растений и животных – полипептид, содержащий 30-50 радикалов аминокислот.
Таким образом, в ходе синтеза белков осуществляется перенос генетической информации, закодированной в виде последовательности кодонов в ДНК, на структуру белков, с помощью которых в клетке осуществляются все биохимические процессы. Процесс передачи генетической информации от ДНК на белки можно представить в виде следующей схемы:
|
В процессе синтеза mРНК на ДНК-матрице последовательность дезоксирибонуклеотидных остатков ДНК переводится в последовательность рибонуклеотидных остатков mРНК. После осуществления процессинга и сплайсинга функционально активные молекулы mРНК связываются с рибосомами и используются в качестве биологических матриц для синтеза полипептидов. Выстраивание на mРНК-матрице аминокислотных остатков происходит с помощью тРНК, которые, присоединив аминокислотный остаток к ЦЦА-концу, переносят его в рибосому на основе комплементарного присоединения своего антикодона к соответствующему кодону mРНК. В результате синтеза полипептидных связей на mРНК-матрице образуется полипептидная цепь, в которой последовательность соединения аминокислотных остатков определяется последовательностью кодонов в mРНК.
В этом процессе чрезвычайна важна роль тРНК. Именно с помощью своего антикодона каждая тРНК, соединяясь комплементарно с кодоном, определяет место аминокислотному остатку в синтезирующейся полипептидной цепи. Учитывая, что существует 61 значащий кодон в молекулах ДНК и mРНК, можно было ожидать и наличие такого же числа тРНК, имеющих соответствующие кодонам антикодоны. Однако обычно клетки организмов в процессе синтеза белков используют меньшее число типов тРНК. Это связано с тем, что при спаривании в ходе синтеза полипептидов кодонов с антикодонами допускаются определённые отклонения от принципа комплементарности, которые характерны для последних нуклеотидных остатков на 3'-конце кодона и 5'-конце антикодона.
Первые два нуклеотидных остатка в кодоне и антикодоне спариваются без отклонений от принципа комплементарности. Третий же нуклеотидный остаток в антикодоне, оканчивающийся на Г, может при взаимодействии с кодоном соединяться с У или Ц. Если третий нуклеотидный остаток на 5'-конце антикодона представлен Ц или А, то он спаривается комплементарно с соответствующим нуклеотидным остатком кодона. Однако если третий нуклеотидный остаток в антикодоне представлен У, то он может спариваться с А или Г соответствующего кодона.
Исходя из выше указанных особенностей спаривания кодонов и антикодонов, мы видим, что в отдельных случаях один антикодон, может спариваться с двумя кодонами, которые отличаются нуклеотидными остатками на 3'-конце, в связи с чем общее число антикодонов, используемых в синтезе полипептидов, может быть меньше существующего числа кодонов. Так, например, в клетках растений для осуществления трансляции используются 37 типов тРНК.
Следует отметить, что процесс переноса генетической информации от ДНК или РНК на белки необратим. Для того чтобы реализовать обратный процесс, потребовалось бы иметь не менее сложную биологическую систему, чем система синтеза белков. Однако такой системы в организмах не существует. Поэтому обратный перенос информации от белков к РНК и ДНК никогда не наблюдался в живых организмах и, по-видимому, невозможен.
На синтез белков затрачивается очень большое количество энергии, которое доставляется в виде АТФ и ГТФ. При активировании каждой аминокислоты затрачивается 1 молекула АТФ, которая подвергается гидролизу до АМФ и Н4Р2О7, затем на стадии инициации синтеза полипептидной цепи в процессе образования способной к синтезу белка рибосомы затрачивается энергия гидролиза ГТФ до ГДФ и Н4Р2О7. В ходе элонгации полипептидной цепи при каждом акте включения в рибосому аминоацил-тРНК и каждой транслокации также затрачивается энергия, высвобождающаяся при гидролизе ГТФ. Как было показано ранее, значительное количество энергии требуется для синтеза mРНК.
Подтверждением правильности представленных выше молеку-лярных механизмов трансляции является создание искусственных бесклеточных систем синтеза белков. Так, например, для синтеза растительных белков в системе in vitro очень часто используют бесклеточный ферментный экстракт из зародышей пшеницы, содержащий молекулы тРНК и ферменты синтеза белков, к которому добавляют аминокислоты, АТФ, ГТФ, очищенные растительные рибосомы и функционально активные mРНК. В указанной бесклеточной системе синтезируются белки, первичная структура которых закодирована в молекулах mРНК. Если в бесклеточную систему синтеза белка добавляют mРНК из созревающих зерновок кукурузы – синтезируется запасной белок зерна кукурузы зеин , а если добавляют mРНК из созревающих семян гороха – образуется легумин гороха. Соответственно с участием mРНК созревающих зерновок ячменя синтезируется гордеин.
В цитоплазме растительных клеток синтез белков осуществляют цитоплазматические 80S-рибосомы, в хлоропластах и митохондриях – рибосомы этих внутриклеточных органелл.
Перенос информации от РНК к РНК. У большинства растительных вирусов и некоторых вирусов животных основным наследственным материалом служит не ДНК, а молекулы РНК. При размножении этих вирусов осуществляется репликация молекул РНК, в ходе которой на родительской цепи РНК на основе комплементарного синтеза образуется полинуклеотидная цепь дочерней РНК с последовательностью нуклеотидных остатков, комплементарной родительской РНК. Синтез молекул РНК на РНК-матрице катализирует фермент, называемый РНК-зависимой РНК-полимеразой, или РНК-репликазой. Для РНК-зависимого синтеза РНК в качестве субстратов используются молекулы рибонуклеозидтрифосфатов.
Перенос информации от РНК к ДНК. Такой перенос информации наблюдается в животных клетках, инфицированных некоторыми вирусами. Наиболее хорошо изучен механизм синтеза ДНК на РНК-матрицах у ретровирусов, содержащих в качестве генетического материала одноцепочечные молекулы РНК.
Попадая в клетку животного, инфекционные частицы ретровируса с помощью содержащегося в них фермента обратной транскриптазы синтезируют ДНК-копию на РНК-матрице, а на вновь синтезированной цепи ДНК катализируют образование комплементарной цепи ДНК, которая при взаимодействии с родительской цепью формирует двойную спираль ДНК, содержащую такую же генетическую информацию, как одноцепочечные молекулы РНК ретровируса.
Затем двойная спираль ДНК-копии ретровируса внедряется в ядерную ДНК животной клетки и вместе с ней подвергается репликации, передавая из поколения в поколение генетическую информацию РНК ретровирусных частиц. В ходе транскрипции ядерной ДНК, содержащей ДНК-копии ретровируса, синтезируются mРНК ретровирусных белков, а также новые одноцепочечные молекулы РНК генома ретровируса, которые, формируя белковую оболочку, превращаются в инфекционные частицы ретровируса.
Очищенные препараты обратной транскриптазы вирусных частиц находят применение в экспериментах по синтезу генов, в которых в качестве матрицы для образования ДНК служат молекулы mРНК. При использовании в качестве матрицы химически модифицированных молекул РНК с помощью фермента обратной транскриптазы возможен также синтез искусственных генов.