Внутримитохондриальное окисление.
Биоокисление – это совокупность всех окислительно-восстановительных процессов, протекающих в живых организмах. Его основные функции:
1) энергетическая (производство энергии для выполнения различных видов работы – мышечного сокращения, трансмембранного транспорта и т.д.);
2) биосинтетическое (путем окислительных реакций могут синтезироваться новые вещества);
3)детоксикационная (обезвреживающая) – некоторые токсические вещества путем окисления превращаются в нетоксичные или менее токсичные вещества. По сути, окисление – это перенос электронов от донора к акцептору. Есть аэробное и анаэробное окисление. Это зависит от того, что является акцептором электронов. При аэробном окислении – это кислород, при анаэробном – другие вещества. Первые попытки объяснить окисление появились в конце 19 – начале 20 вв. Возникло несколько теорий, которые объясняли окислительную способность кислорода его предварительной активации. Это, например, теория А.Н. Баха (перекисная теория). Он считал, что в организме есть некоторые вещества, которые легко взаимодействуют с кислородом, образуя перекиси:
O
R + O2 R |
O
Образовавшаяся перекись, будучи сильным окислителем, окисляет все остальные субстраты. А.В. Палладин предложил дегидрогеназную теорию, согласно которой от субстрата отщепляется под действием дегидрогеназ протоны и электроны и тем самым субстрат окисляется. Большое влияние на развитие учения о биокисление имели работы О. Варбурга, Кребса, Митчелла, В.А. Энгельгардта, В.П. Скулачева и других. Например в 20 –30 гг. Г. Виланд, Т. Тунберг и Д. Ксилин установили промежуточные переносчики электронов. Выделяют внутримитохондриальное окисление (протекает на внутренней мембране), окисление на внешней мембране, внемитохондриальное (протекает в эндоплазмотической сети (микросомальное), в цитозоли, пероксисомах) – играет биосинтетическую и обезвреживающую функцию. Хотя некоторые бактерии (анаэробные) способны жить без кислорода, жизнь высших животных полностью зависит от снабжения кислородом. Кислород используется, главным образом в процессе дыхания. Дыхание можно представить как процесс последовательного переноса электронов, полученных при окислении какого-либо субстрата, на кислород с последующим соединением кислорода с водородом с образованием воды. Выделяющаяся при этом химическая энергия улавливается клеткой и превращается в удобную для организма форму – АТФ и другие макроэрги. Эти процессы происходят в митохондриях. Митохондрии найдены во всех эукриотических клетках, однако их размер, форма и число меняются от одной клетки к другой. Установлено, что эти изменения происходят в ответ на изменение в метаболизме и в результате старения клеток. Также они могут быть связаны с различными патологическими изменениями в самих клетках. В клетках животных митохондрии часто имеют вытянутую (палочкообразную) форму; длинна 1,5 – 2,0 мкм, диаметр 0,5 – 1,0 мкм. Размер митохондриии составляет примерно 1/20 размера ядра и приблизительно равен размеру кишечной палочки. В клетках, характеризующихся высоким уровнем метаболизма их число может быть весьма больше. Например каждая клетка печени содержит около 1000 (500 до 2000) митохондрий. В то же время, клетки, участвующие в анаэробном (кислороднезависимом) метаболизме (например, клетки скелетных мышц) содержат лишь несколько митохондрий. Для печени общая площадь внутренней мембраны равна 40 кв. м / г митохондриальной ткани, для сердца – 200 кв. м /г. При использовании электронной микроскопии (увеличение примерно в 95000 раз) установлено строение митохондрий (мембранная система и довольно много внутримитохондриальных структур). При ближайшем рассмотрении оказалось, что система мембран представляет собой двойную мембрану – то-есть две отдельные мембраны, разделенные межмембранным пространством. Тогда как окружающая митохондрию внешняя мембрана гладкая, у внутренней мембраны имеются много нерегулярно расположенных складок, выступающих внутрь митохондрий. Такие складки внутренней мембраны называют также кристами. Это резко увеличивает общую площадь мембраны. Район вокруг крист заполнен внутримитохондриальной жидкостью и называется митохондриальным матриксом.
Митохондрии отвечают за основные процессы аэробного метаболизма в клетке, в том числе за такие жизненно важные, как цикл трикарбоновых кислот и окислительное фосфорилирование. Совместно эти процесы производят почти всю энергию, необходимую для роста и выживания клетки. Молекулярные процессы, ответственные за получение энергии, происходят на поверхности внутренней мембраны, особенно в клетках.
Матриакс митохондрий так же содержит ДНК. Ее количество невелико (примерно 2 – 4 % общего содержания ДНК в клетке). Предполагается, что митохондриальная ДНК содержит генетическую информацию, необходимую для развития митохондрий. Наличие в митохондриях рибосом и некоторых ферментв, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот, говорит в пользу этого предположения. Другими словами , в крупных клетках митозондрии, возможно, представляют вторичную микроклетку, способную синтезировать свои собственные белки, используя собственную генетическую программу. Есть предположение, что митохондрии произошли от примитивных бактерий. Это возможно, объясняется происшедшим на ранней стадии эволюции инфицированием развивающегося эукариотического организма парсзитной митохондриеподобной бактериальной клеткой. В дальнейшем процессы жизнедеятельности клетки-хозяина и бактериальной клетки дополняли друг друга и могли развиваться как единое целое.
Билогическое окисление (в клетках его называют тканевое дыхание) – это совокупность всех реакций окисления, протекающих во всех живых клеткх. Основная функция этого процесса – обеспечение организма энергией в доступной для использования форме (прежде всего в форме АТФ). Особенностью биологического окисления в митохондриях является то, что оно протекает постепенно, через многочисленные промежуточные ферментативные стадии, то-есть происходит многократная передача протонов и электронов от донора к акцептору. У аэробов конечным акцептором протонов и электронов служит кислород. Г. Виланд, Т. Тунберг, Д. Кейлин (1920 – 1930 гг.) установили промежуточные переносчики электронов. Как правило, полный процесс транспорта электронов от исходного донора электронов – востановленного субстрата (SH2) к терминальному акцептору электронов – кислороду, выглядит как цепь последовательных окилительно-восстановительных реакций, в ходе которых происходит взаимодействие переносчиков. Каждый промежуточный переносчик вначале выступает как акцептор электронов, будучи в окисленном состоянии и, приняв электроны, восстанавливается, передавая затем электроны следующему переносчику, тем самым вновь возвращается в окисленное состояние. На последней стадии переносчик передает электроны кислороду, который восстанавливается до воды. Совокупность последовательных окислительно-востановительных реакций называется цепью переноса (или транспорта) электронов или дыхательной цепью. Дыхательные системы в митохондриях строго структурированы, окисление идет в основном на внутренней мембране митохондрий, которая имеет весь необходимый набор дыхательных систем, которые обеспечивают перенос электронов с субстрата на кислород и утилизируют выделяющуюся при этом энергию. То-есть в митохондриях окисление имеет в первую очередь энергетическое значение.
Основная дыхательная цепь в митохондриях имеет следующий вид:
SH2 НАД+ (НАДФ+) ФМН FeS KoQ цВ FeS цС1 цС
SH2 ФАД FeS цА1А3 О2
В высших организмах промежуточными переносчиками в дыхательной цепи являются:НАД(никотинамиддинуклеотид) (НАДФ(никотинамиддинуклеотидфосфат)), ФАД и ФМН, КоQ, семейство белков – цитохромов (гемсодержащие белки) и белки, содержащие негеминовое железо, то-есть белки содержащие железо-сероцентры. Рассмотрим все эти системы. Можно сказать что существуют полная и укороченная дыхательные цепочки. Процесс начинается с переноса электронов от восстановленного субстрата (SH2) к НАД или ФАД. Это определяется тем, является ли дегидрогеназа, катализирующая первую стадию, НАД – или ФАД – зависимой. Если процесс процесс начинается с НАД, то следующим переносчиком будет ФМН. Каким бы не был исходный субстрат, электроны от флавина переносятся к
КоQ, а затем в ходе определенной последовательности реакций переноса цитохромами достигают кислорода – терминального акцептора электронов.
1)НАД – и НАДФ – зависимые дегидрогеназы (где НАД и НАДФ – ко-ферменты). Описано более 250 таких ферментов. Это белки, молекулярная масса 70000 – 100000 Дальтон, часто в активных центрах содержат – тиогруппы (соответственно, подвержены воздействию тиоловых ядов), в ряде случаев содержит металлы. Отмечается специфичность ферментов в отношении НАД или НАДФ (или - или). Например, НАД-зависимый фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ). НАДф-зависимый - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. А вот глутаматдегидрогеназа активна и в присутствии НАД, и в присутствии НАДФ. Изоцитратдегидрогеназа активна и в присутствии НАД и в присутствии НАДФ (в зависимости от вида изофермента). НАД (НАДФ)-зависимые ДГ катализируют следующие реакции: от субстрата под действием фермента отщепляется два протона и два электрона, акцептором которых являются НАД или НАДФ:
НАД НАДН
(НАДФ) (НАДФН)
 |
SH2 S + 2H+
дегидроенза
СН СН2
СОNH2 CONH2
+Н2, + 2 е + Н(+)
 | |||
 | |||
N(+) – R N – R
Никотинаимид (витамин РР) НАДН (НАДФН)
(это фрагмент НАД или НАДФ)
При недостатке витамина РР развивается пеллагра (дерматит, диарея, деменция).
Обычно НАД представляет собой свободный ко-фермент, связывающийся с ДГ только в ходе реакции. Поступают НАД и НАДФ из цитоплазмы.
2) ФАД и ФМН-зависимые ДГ обычно ковалентно связаны с ДГ, так что целиком весь белок называют флавопротеидом (ФП). ко-ферменты ФАД и ФМН содержат и металлы, поэтому иногда говорят: металлофлавопротеиды. Например, сукцинат-ДГ содержит железо, ксантиноксидаза – молибден. Атомы металлов, входящих в состав этих ферментов, могут легко изменять свою валентность, присоединяя или теряя электроны. ФАД и ФМН имеют следующую структуру: Флавин – рибитол – фосфорная кислота (ФМН).
Флавин – рибитол – фосфорная кислота – фосфорная кислота – рибоза – аденин (ФАД)
Флавин (изоаллоксазин) + рибитл = витамин В2 (рибофлавин). Этот витамин активно участвует в окислительных процессах. При недостатке витамина В12 развивается поражение кожи, глаз и т.д.
При окислении какого-то субстрата, от него ходе реакции, катализируемой этими ферментами отщепляется водород и электроны, но ФАД и ФМН, присоединяя их и при этом восстанавливаясь, очень быстро отдают их на какой-акцептор. Причем, флавиновые ферменты иногда окисляют определенные субстраты (ксантин, глицерофосфат, янтарную кислоту и т.д.), а могут окислять восстановленные формы НАДН и НАДФН. Акцептором может быть кислород (в таком случае ферменты называются оксидазы, а кислород присоединяет один или два электрона), убихинон, цитохромы и т.д.
рибитол фосфорная кислота рибитол фосфорная кислота
CH3
N N +2е- CH3 N NH
+2Н+, O
NH NH
N || NH ||
СН3 O CH3 O
ФМН (фрагмент) ФМН – Н2 (фрагмент)
(изоаллоксазин)
3) КоQ (убихинон) – это жирорастворимое вещество. Для человека и млеопитающих n = 10, микробы – n = 6.
О ОН
О – СН3 || +2Н |
СН3 +2е- Н3СО СН3 СН3
|
СН2 СН3 Н3СО СН2 – (СН2 – С – СН2)nН
О –СН3 || | | |
О (СН = С – СН2)nН ОН
Хинон Гидрохинон
Белковая цепочка и определяет гидрфобность вещества. С убихинона электроны поступают на систему цитохромов, а протоны поступают в раствор (в межмембранное пространство).
4) Белки, содержащие жыелезосероцентры. Эти белки содержат негеминовое железо, то-есть в их составе нет гема, а железо образует комплекс с белком, при этом атомы железа связаны с атомами серы. Простетические группы этих белков представлены FeS; (FeS)2; (FeS)4 и т.д. Эти белки активно участвуют в переносе электронов, который осуществляется за счет изменения валентности железа в составе железосероцентров. Точная локализация их до сих пор не установлена, также как и механизмы окисления – восстановления.
5) Система цитохромов – это белки, простетическая группа которых представлена гемом. Цитохромы («клеточные пигменты») впервые обнаружены в конце 19 века. В природе известно 25 – 30 цитохромов. Локализованы главным образом в мембранах митохондрий и в эндоплазматическом ретикулуме. Отличаются по виду белкового компоненту, по некоторому изменению белковых радикалов гема (вместо виниловой группировки изопреноидная цепь и т.д.) и по виду соединения гема с белком. Отличаются цитохромы друг от друга и по величине редокс-потенциала. Все цитохрмы поглощают свет в области 500 – 600 нм. Цитохромы разделяют на А, В, С в зависимости от редокс-потенциала и от спектра поглощения, а затем, например, В делят на В1, В2, В3 и т.д. Основная роль цитохромов – перенос электронов, что осуществляется за счет изменения валентности железа, содержащегося в геме (Fe++ Fe+++).
Цитохромоксидаза – фермент, окисляющий цитохром С, состоит из 7 субъединиц. В ее состав входит два цитохрома (А, А3), ионы меди. Молекулярная масса равна 200000 Дальтон. Осуществляет перенос электронов с цитохрома С на кислород (при этом кислород принимает сразу 4 электрона, восстанавливаясь до воды), так как в составе цитохромоксидазы два гема (А + А3). Цитохромы А и А3 очень трудно выделить в чистом виде, поэтому можно предположить, что они существуют в виде единого прочного комплекса. Другая особенность комплекса состоит в том, что ионы меди также участвуют в переносе электронов, как и ионы железа, содержащиеся в геме, входящие в состав этих ферментов. Fe++ Fe+++ + e-; Cu + Cu++ + e.
Уникальная особенность комплекса А – А3 заключается в том, что эта система цитохроиов непосредственно реагирует с молекулярным кислородом. Поэтому комплекс А – А3 и называется цитохромоксидаза. Движение электронов по дыхательной цепи возможно только в одном направлении из-за разници редокс-потенциалов у разных переносчиков: НАД/НАДН – (- 0,32 вольта); ФМН/ФМНН – (- 0,12 вольт); КоQ/KoQH – (+ 0,10 вольт); цВ – (+ 0,04 вольта); цС1 (+ 0,22 вольта); цС – (+ 0,25 вольт); цАА3 – (+ 0,29 вольт); О2 – (+0,82 вольта). Системы, которые характеризуются большим отрицательным потенциалом, способны в большей мере отдавать электроны, а системы с большим положительным потенциалом лучше присоединяют. Теперь становится понятным почему возникла именно такая последовательность реакций (НАД флавин СоQ ……цитохромы О2). Обратите внимание, что редокспотенциалы в этой последовательности (за исключением пары СоQ) постепенно становятся все более положительными. Другими словами, переносчики расположены в соответствии с их все возрастающей способностью к восстановлению. С энергетической точки зрения это означает, что каждый переносчик в своем восстановленном состоянии представляет более высокоэнергетическое соединение, чем восстановленная форма следующего в цепи переносчика. Другими словами электроны переходят на более низкий энергетический уровень. Например, если цепь начинается с НАДН, перенос электронов на первой стадии к ФМН с образованием НАД+ и ФМНН2 является энергетически выгодным процессом. Поскольку эта закономерность сохраняется вдоль всей цепи, ясно виден термодинамический принцип : переносчики электронов расположены таким образом, что каждый акт переноса происходит самопроизвольно и экзэргонически (несоответствие этому принципу пары СоQ следует рассматривать, имея в виду, что его редокс-потенциал измеряли в 95% этаноле, тогда как в клетке его следует считать приближенно равным 0,006 ). Очень важно, что участие промежуточных переносчиков электронов приводит к выделению энергии порциями. При изучении последовательности в дыхательной цепи (1960 год) были выделены 4 дыхательных комплекса, каждый из которых способен катализировать определенную часть полной последовательности реакции дыхательной цепи. В экспериментах по выделению комплексов испльзовались различные ингибиторы дыхания.
1) Комплекс №1 (НАДН – КоQ - оксидоредуктаза) – катализируют перенос электронов от НАДН к КоQ.
2) Комплекс №2 (сукцинат – КоQ – оксидоредуктаза ) – катализирует перенос электронов от сукцината (янтарной кислоты) к КоQ.
3) Комплекс №3 (КоQН – цС - оксидоредуктаза) – катализирует перенос электронов от КоQН к цС.
4) Комплекс №4 (цитохромоксидаза) - катализирует перенос электронов от цС к О2 .
При выделении и изучении характеристики дыхательных компонентов появилось много данных, свидетельствующих в пользу того, что компоненты дыхательной цепи находятся во внутренней митохондриальной мембране в виде высокоупорядоченных ансамблей. Накоплены обширные данные, говорящие о том в топологии ансамблей существует отчетливая асимметрия, то-есть некоторые из белков-переносчиков расположены на одной стороне внутренней мембраны митохондрий, другие – на другой, а некоторые пронизывают мембрану насквозь. Предполагается, что такое расположение переносчиков необходимо для более эффективного улавливания химической энергии, используемой для синтеза АТФ. Для каждого компонента характерны свои ингибиторы.
1) Амитол, амобарбитал (производные барбитуровой кислоты);
2) карбоксин (окисел.);
3) антимицин А (антибиотик);
4) цианиды (соли синильной кислоты).
При внутримитохондриальном окислении используется 80 – 90% всего потребляемого кислорода и в итоге восстановления кислорода образуется вода. В эпоху образования земной атмосферы (4,5 – 4,8 млрд. лет назад) в ней отсутствовал кислород. Он появился около 2 млрд. лет назад в результате деятельности фотосинтезирующих организмов, первыми из которых были сине-зеленые водоросли. А до тех пор единственными живыми существами были анаэробные бактерии. Постепенное накопление кислорода вызвало последующее развитие аэробных организмов (первые из которых появились около 1,5 млрд. лет назад). Рассматривая механизм внутримитхондриального окисления, мы убедились, что конечным акцептором электронов у аэробов является кислород. Используя кислород в качестве терминального окислителя, аэробные клетки могли получать больше энергии при окислении пищевых продуктов, например, глюкозы, поскольку субстрат в этом случае мог быть полностью окислен до углекислого газа и воды:
анаэробно
Глюкоза 2лактат + 56 ккал (моль глюкозы)
аэробно
Глюкоза + 6 О2 6СО2 + 6НОН + 686 ккал (моль глюкозы)
Поэтому аэробные организмы имели преимущество перед анаэробными и широко распространились. Некоторые (а может быть и многие) анаэробные организмы кислород просто убивал. Известно, что кислород действительно токсичен для живых организмов. Так почему же аэробные организмы способны выжить в атмосфере кислорода? В невозбужденном состоянии кислород не токсичен. Однако его электронная структура, содержащая два неспаренных электрона, накладывает ограничения на то, каким образом кислород способен выступать в роде акцептора электронов.
Известно около 200 ферментов, использующих молекулярный кислород в качестве одного из субстратов. Все они разделяются на два класса в зависимости включается или нет кислород в другой субстрат в ходе такой реакции:
1) оксидазы – кислород не включается, а используются только как акцептор электронов,
2) оксигеназы – кислорд включается в другой субстрат.
В свою очередь, оксидазы можно разделить: а) генерирующие воду; б) генерирующие перекись водорода. Существует также 2 типа оксигеназ: а) монооксигеназы (гидроксилазы) – включает только один атом кислорода; б) диоксигеназы включают оба атома кислорода.
К первому виду оксигеназ (то-есть генерирующих воду) относится цитохромоксидаза, которая принимает участие во внутримитохондриальном окислении. Второй вид оксидаз участвует в окислении на внешней мембрне митохондрий,, а оксигеназы катализируют процессы внемитохонриального окисления.
Итак, окисление субстратов присходит не только на внутренней мембране митохондрий но и на внешней мембране и внутримитохондриально. На внешней мембране окисление идет при помощи флавиноых ферментов, которые переносят электрон прямо на кислород:
RH2 ФП О2. Так окисляются различные амины, некоторые аминокислоты, ксантин, дигидрооротовая кислота и т.д. При таком окислении молекула О2 присоединяет или 1 или 2 электрона (при внутримитохондриальном окислении, как мы говорили, присоединяется 4 электрона). Рассмотрим, что происходит с кислородом при различных вариантах присоединения электронов.
1)О2 + е- О2-* + Н(+) НО2*
Супероксидный гидроксильный
Анион-радикал радикал
2) О2 + 2е О2 (-2) + 2Н(+) Н2О2
пероксидный анион-радикал
3) О2 + 4е 2 О2 (-2) + 4Н(+) 2НОН
Супероксидный радикал может участвовать и в образовании еще одной формы активного кислорода:
2О2*(-) + 2Н(+) `О2 + Н2О2
Это неферментативная обратимая реакция дает синглетный кислород (`О2). Это переходное возбужденное состояние кислорода.
В свою очередь, перекись водорода при взаимодействии с железом может дать и гидроксильный радикал, самый сильный из известных окислителей:
Fе++ + Н2О2 Fе+++ + ОН- + ОН*
Получаемые в результате этх реакций свободные радикалы (обозначаются точкой) и активные формы килорода очень опасны, так как являются очень сильными окислителями (оксидантами). Молекулы каждого из этих видов представляют собой опасность для живых клеток вследствие повреждений, которые они способны причинить всем видам биомолекул, особенно белкам и липидам. Другими словами токсичность кислорода обусловлена токсичностью активных соединений, которые могут из него образовываться. По сути, под свободным радикалом принято понимать молекулу, или ее часть, имеющую неспаренный электрон на молекулярной или на внешней (валентной) атомной орбите, то-есть у молекулы или у атома появляется свободная валентность. Это и обуславливает высокую химическую активность свободных радикалов. Свободные радикалы не стабильны, так как они обладают большой реакционной способностью. В биологических системах свободные радикалы образуются либо в качестве нормальных продуктов обмена веществ, либо возникают при измененных условиях жизнедеятельности (при действии на клетку ионизирующего излучения, токсических веществ, многих заболеваниях). Много свободных радикалов образуется и при окислительно-восстановительных реакциях, в том числе и при работе дыхательной цепочки. То-есть в организме человека постоянно происходит процессы свободно-радикального окиления, интенсивность которых наиболее велика в липидах (особенно в фосфолипидах). Считается, что свободные радикалы составляют до ¼ от общего числа активных частиц нормально функционирующих тканей.
Для свободных радикалов характерны цепные реакции, то-есть процессы, в которых участвуют свободные радикалы, вызывают цепь превращений молекул вещества, порождая новые активные свободные радикалы, легко реагирующие с другими молекулами. Часто в реакциях образования свободных радикалов принимают участие ионы металлов с переменной валентностью (чаще всего железо). Поскольку промежуточным продуктом разветвленных цепных реакций являются перекиси и скорость данных реакций зависит от их концентраций, весь это процесс называют перекисным окислением.
Как видно из сказанного, свободно-радикальное окисление, хотя и имеет место при нормальных физиологических процессах, может привести к нежелательным последствиям. В норме эти радикалы могут использоваться для обновления липидов мембран, для фагоцитоза (их много в фагоцитах), для синтеза активных биологических веществ (например, простогландинов). Но их в норме мало, а при патологии их количество значительно увеличивается и они повреждают мембраны, белки, нуклеиновые кислоты и т.д. Вещества которые предотвращают развитие цепных реакций, называются антиокисданты.
В организме существует мощная антиоксидантная система защиты:
1) СОД (супероксид) катализирует реакцию О2*- + О2*- О2(-2) + О2 затем
О2(-2) + 2Н+ Н2О2. Эту реакцию установили в 1969 году И. Фридович и Дж. Мак-Корд. СОД обнаружена во всех типах аэробных клеток, что подтверждает ее роль в механизме самозащиты организма от токсического дейсствия кислорода. У анаэробов этот фермент отсутствует, что, вероятно, и объясняет токсичность кислорода для анаэробных клеток. В последнее время появились данные, что полиморфноядерные лейкоциты (гранулоциты) выделяют большое количество О2*- в период активности дыхательных метаболических процессов, способствующих развитию их в фагоциты, которые участвуют в переваривании и разрушении чужеродных частиц, бактерий и других клеток.
Помимо уничтожения бактерий О2*-, по-видимому, повреждает другие ткани, вызывая воспалительные процессы. Так ревматоидные артриты часто сопровождаются выбросом полиморфоядерных лейкоцитов в суставную сумку. Для устранения воспалительных процессов было предложено использовать СОД как противовоспалительный препарат в виде инъекций.
2) Каталаза катализирует реакцию 2Н2О2 2Н2О + О2
Н2О2 обезвреживается и при действии пероксидаз:
Н2О2 + ХН2 (пероксидаза) Х + 2Н2О.
3) Сильным антиоксиднтным действием обладают витамины: Е, С, К.
4) Некоторые аминокислоты (триптофан и фенилаланин).
5) Тиреоидные и стероидные гормоны, эстрогены.
6) Биологически активные пептиды (глютатион).
7) Серусодержащие ферменты, глютатион – S – трансфераза.
Внемитохондриальное окислене проходит, в основном, в ретикуло- эндоплазматческой сети (фрагменты ретикулума называют микросомы). Часто эти процессы происходят с участием оксигеназ. Различают ди- и монооксигеназы. Работа диоксигеназ часто сопровождается разрывом циклических структур:
CH2- CH-COOH + О2 C-CH2-CH-COOH
| || |
NH NH2 триптофанпиролаза O NH2
Триптофан NH-C=O
|
H
Формилпуреин кислота.
Общая формула работы диоксигеназ: R+О2 RО2. Монооксигеназы катализируют присоединение одного атома кислорода, при этом не редко образуются гидроксогруппы, поэтому их иногда называют гидроксилазы. Упрощенная схема действия монооксигеназ:
RН2+О2+ХН2(ко-фактор) RНОН+НОН+Х (окисленная форма ко-фактора). В качестве ко-фактора могут выступать НАДН2, НАДФН2, аскорбиновая кислота и т.д. В этих часто принимает участие цитохромы Р450, В5, флавиновые ферменты. Важный пример монооксигеназной активности представляет группа ферментов, которые все вместе называются цитохромы Р450. В эукариотических клетках они обычно локализованы в мембранах ретикулума. Они названы так потому, что при связывании оксида углерода в их спектре появляется сильная полоса поглощения при 450 нм. Цитохромы Р450 могут действовать и на нормальные клеточные компоненты и на многие чужеродные соединения, в том числе и лекарства различной природы. Иногда цитохромы Р450 учасивуют при детоксикации различных чужеродных соединений. Однако, в некоторых случаях под действием цитохрома Р450 эти соединения превращаются в продукты с цитостатическими, мутагенными или канцерогенными свойствами. Возможно окисление с участием пероксидаз. Есть внутриклеточные образования – пероксисомы, в которых сконцентрированы пероксидазы. Механизм этого окисления: RН2 + ХООН R + НОН + ХОН. Наиболее часто в качестве пероксидазы ыступает перекись водорода:
RН2 + НОН 2НОН + R Это типичная реакция для тканей.
Глютатионпероксидаза окисляет глютатион. Каталаза тоже относится к пероксидазам:
Н2О2 + Н2О2 (каталаза) 2Н2О + О2.
Жизнь и рост клетки зависит от пищи не только, как от источника углерода, азота, серы, фосфора и других биологически необходимых элементов, но так же как от источника энергии. В отсутствии источника энергии клетка не может синтезировать многочисленные соединения, необходимые для ее жизнедеятельности, не способны к активному мембранному транспорту и не в состоянии двигаться и выполнять специальные физиологические функции, например, участвовать в сокращении мышц, передавать нервные импульсы и т.д. Описанием энергетически любой системы – живой или неживой, органической или не органической, химической, физической или биологической – занимается термодинамика. Существуют термодинамические понятия внутренней энергии (она представляет собой полную энергию системы), энтальпии (это тепловое содержание системы), энтропии (характеризует степень неупорядоченности системы), и свободной энергии (эта та энергия, которая доступна для превращения в полезную работу). Свободная энергия представляет собой термодинамический параметр, прямо связанный с химической стабильностью системы. Это означает, что высокое значение свободной энергии присуще потенциально неустойчивой системе, которая при определенных условиях самопроизвольно будет переходить на более низкий уровень свободной энергии, при этом часть энергии будет выделятся. Такая реакция является экзэргонической реакцией, она является термодинамически выгодной. Выделенная энергия может быть использована для совершения полезной работы. Если результатом реакции является переход от устойчивого состояния с низкой химической энергией к менее устойчивому состоянию с большей химической энергией, такие реакции называются эндэргоническими, они являются термодинамически невыгодными, то-есть не могут протекать самопроизвольно в отсутствии источника энергии, то-есть для ее осуществления необходимо осуществить работу. Если бы экзэргонические реакции протекали сами по себе, выделяющаяся при этом химическая энергия терялась бы, в первую очередь в виде тепла. Однако, если б она протекала одновременно с эндэрганической реакцией, выделяющаяся в ходе экзэргонической реакции энергия использовалась бы в ходе эндэргонической реакции. Такой процесс носит название энергетического сопряжения и представляет собой основной способ использования энергии в живом организме. Более доступной формой энергии, использующейся в метаболических процессах, является АТФ либо другие макроэргические соединения. При гидролизе различных связей образуется различное количество свободной энергии. Так, в процессе гидролиза связи, образованной Н3РО4 выделяется, в зависимости от субстрата, 2 – 13 ккал / моль. Те вещества, которые при расщеплении дают большое количество энергии (7 – 13 ккал / моль) называются макроэргами. Макрэргами являются АТФ, ГТФ, УТФ (то-есть все нуклеозид-трифосфаты), ацилфосфат (например, глицерол-1,3-дифосфат при гидролизе дает 11,8 ккал), тиоэфиры (основные тиолсодержащие соединения в природе – коэнзим А (КоА), линолевая кислота и белки с тиогруппой, КоА включает в себя остаток пантотеновой кислоты – очень важный витамин, гидролиз ацетил КоА равен 7,5 ккал), НАД и НАДФ, ФАД и ФМН – их восстановленные формы представляют собой высокоэнергетические соединения. К макроэргам относится креатинфосфат (при гидролизе дает 10,3 ккал), фосфоенолпируат (при гидролизе дает 14,8 ккал ). Нуклеозид-трифосфаты (НТФ) участвуют во многих реакциях синтеза. Например ЦТФ принимает участие в синтезе фосфолипидов, УТФ – в биосинтезе и взаимных превращениях углеводов, а все продуты этих процессов утилизируются затем в биосинтезе ДНК и РНК. Особую роль среди всех НТФ принадлежит АТФ. Во всех живых клетках АТФ выступает в качестве депо для хранения и переноса химической энергии. Эту функцию можно в общих чертах представить так: АТФ АДФ + фос-
форная кислота. Химическая природа этих превращений проста – разрыв фосфоангидридной связи в результате гидролиза АТФ или образование этой связи в ходе фосфорилирования АДФ (синтез АТФ). Этот процесс и представляет молекулярную основу переноса химической энергии внутри всех живых клеток. При разрушении высокоэнергетических компонентов пищи (например, углеводов), освободившаяся при этом энергия идет на синтез АТФ. Если клетка нуждается в энергии (для различных синтетических процессов, сокращения мышц, транспорт через мембраны и т.д.) – АТФ гидролизуется с выделением энергии. При определении значения выделяющейся при гидролизе АТФ энергии были получены цифры от 7 до 9 ккал. Основная трудность определения этого значения заключается в том, что гидролиз АТФ очень чувствителен к изменению температуры, рН и концентрации ионов магния. В живой клетке условия чрезвычайно изменчивы, а концентрации уж никак не соответствуют стандартным условиям. Наиболее вероятным для живых клеток является значение примерно 11 ккал (или даже больше). В большенстве литературных источников используются для интерпритации значение 8 ккал. Если при гидролизе АТФ энергия выделяется, то для синтеза АТФ путем расформирования АДФ энергию необходимо затратить. На это необходимо прмерно 12 ккал / моль. Живая клетка способна регулировать свот химические процессы в ответ на изменения внутриклеточной концентрации АТФ и АДФ. На низкое содержание АТФ (из-за повышения скорости расхода энергии) клетка отвечает ускорением АТФ-синтезирующих метаболических реакций и наоборот. АТФ может синтезироваться путем субстратного фосфорилировния, однако в большинстве клеток главным процессом синтеза АТФ является окислительное фосфорилирование.
ЭНЕРГИТИЧЕСКИЙ ОБМЕН.
В обычных тепловых машинах освобожденую энергию можно использовать по схеме: окисление тепло работа, при этом
Т1 – Т2 где Т – температура.
КПД =
Т1
Но в клетке разницы (Т1-Т2) нет, то-есть эта схема не пойдет.
Работами В.А. Энгельгардта (1932 год), В.А. Белицера (1939 год) было установлено, что в процессе дыхания, при переносе электронов происходит образование АТФ. Это процесс получил название окислительное фосфорилирование. Принципы окислительного фосфорилирования заключаются в следующем: образование АТФ из АДФ и фосфорной кислоты сопряжено с процессом электронного транспорта, при котором электроны высокоэнергетического донора переносятся промежуточными переносчиками к терминальному акцептору электронов с образованием низкоэнергетического продукта. Такой тип реакций является общим для всех организмов и представляет собой универсальный биохимический принцип нашей биосферы. Необходимым условием процесса окислительного фосфорилирования в большинстве нефотосинтезирующих клеток является синтез высокоэнергетических доноров электронов, например, НАДН, ФАДН2, в ходе катаболизма. Принцип окислительного фосфорилирования применим и к фотосинтезирующим клеткам, но в этом случае он начинается с синтеза высокоэнергетических доноров электронов, отличных от НАДН, причем этот процесс происходит за счет световой энергии и его называют фотофосфорилирование. Таким образом, энергия, необходимая для синтза АТФ, берется за счет химической энергии, выделяющейся при переносе электронов по дыхательной цепочке.
Есть зависимость между процессами переноса электронов и изменением свободной энергии: F = - 23n E, где: F – свободная энергия (та часть, которая используется на работу). 23 – коэффициент. n – число электронов, переносимых на молекулу кислорода (их по дыхательной цепи переносится два).
Е – разность потенциалов. Для дыхательной цепи между НАДН (-0,32) и о/в кислородом (+0,82) = 1,14в. Следовательно F для дыхательной цепи при переносе двух электронов на кислород равна 52 ккал / моль.
Концепция: окисление синтез АТФ работа была сформулирована еще в 1941 году. С тех пор было сформулировано три теории окислительного фосфорилирования.
1) Химическая (предполагался химический посредник между окислением и синтезом АТФ, но его не нашли).
2) Конформационная (предполагалось, что ферменты, участвующие в окислении, меняют конформацию, переходя в возбужденное состояние, но это не объясняло весь механизм окислительного фосфорилирования ).
3) Хемиосмотическая (теория П.Митчелла): (1961) год в основе теории предлжено наличие целостных, непроницаемых для протонов мембран. Мембраны митохондрий состоит из внешней и внутренней мембраны. А окисление, как мы знаем, происходит на внутренней мембране митохондрий. В процессе дыхания (окисления), на одной стороне внутренней мембраые митохондрий (точнее, в межмембранном пространстве) концентрируются протоны, то-есть по обе стороны внутренней мембраны создается различная концентрация протонов, что приводит к возникновению двух сил: разности концентраций рН и, поскольку протон имеет заряд, разности потенциалов Фи. Сумма этих двух сил называется протон-движущей силой, или протонным поетнциалом:
рН + Ф = Н(+). То-есть по Митчеллу: окисление АТФ работа.
Но, чтобы синтезировать АТФ из АДФ и Н3РО4, используя энергию протонного потенциала, нужен фермент. Давно была найдена АТФ-аза, которая катализирует гидролиз АТФ. Затем нашли протонную АТФ-азу, которая катализирует синтез АТФ. Ее называют иногда АТФ-синтетазой. Она отличается от обычной АТФ-азы тем, что имеет в своем составе дополнительных пять белков, которые способны проводить протоны через мембрану (через так называемые протонные каналы), способствуя синтезу АТФ. Протонная АТФ-аза встроена во внутренюю мембрану митохондрий
Внешняя
мембрана
Протонный канал
Внутренняя
Мембрана
По протонному каналу протоны резко устремляются из меж мембранного пространства в матрикс. Утолщение (на месте встроенной АТФ-азы) – это фосфорилирующая часть, где и идет активация АДФ и Н3РО4 (активируются протонами) и идет синтез АТФ. Процесс переноса электронов (дыхание) и образование АТФ прочно сопряжены. Принцип сопряжения состоит в том, что энергетически выгодная реакция связана с образованием продукта, которое само по себе не выгодно. То-есть по сути идет сопряжение энд- и экзэргонических реакций. Так, процесс переноса электронов (сопровождающийся выделением энергии, то-есть экзэргоническая реакция) в сопряжении с синтезом АТФ из АДФ и не органического фосфата (требующим затрат энергии, то-есть эндэргоническая реакция). Если в среде отсутствуют АДФ и Н3РО4, то прекращается перенос электронов (дыхание), а если внести в среду АДФ, то увеличивается потребление кислорода (это феномен называется дыхательный контрль). Для определения эффективности работы дыхательной цепи с процессом синтеза АТФ используется коэффициент Р/О, показывающий число молей Н3РО4, пошедших на синтез АТФ путем фосфорилирования АДФ при переносе двух электронов н кислород. Было показано, что в процессе переноса двух электронов по дыхательной цепи на кислород, коэффициент Р/О в идеальных условиях равен трем (это при полном сопряжении), то-есть образуется три молекулы АТФ. При этом утилизируется около 50% энергии (для синтеза АТФ), остальная идет на тепло.
Молекулы АТФ синтезируются на определенных участках дыхательной цепи, которые называются участками дыхательной цепи, которые называются участками сопряжения. В длинной цепи – это 1), 3), 4), комплексы, в укороченной – 3), 4) – дыхательные комплексы.
Регуляция окислительного фосфорилирования идет путем дыхательного контроля, то-есть большая концентрация АДФ ведет к повышению скорости переноса электронов, и, напротив, высокая концентрация АТФ снижает скорость переноса электронов, то-есть снижает потребление кислорода.
Мы говорили, что Р/О в идеальных условиях равно трем. Но это в идеальных условиях. В то же время окислительное фосфорилирование может быть нарушено различными ингибиторами:
1) могут действовать ингибиторы на дыхательную цепь, нарушая передачу электронов (это разные ингибиторы на разные дыхательные комплексы – антимицин А и т.д. Мы о них уже говорили).
2) Действуют разобщители (то-есть вещества, не нарушающие окисление, а ингибирующие только процесс синтеза АТФ) – динитрофенол (ДНФ), молекулы жирных кислот. То-есть разобщителями становятся вещества (например, слабые кислоты), которые растворимы в жирах, так как они позволяют протонам самостоятельно проходить через мембраны, нарушая действие протон-движущей силы. Действие разобщителей подтверждают правильность хемиосмотической теории. Согласно этой теории для синтеза АТФ необходимо возникновение протонного потенциала, основой которго является появление разности концентраций Н(+) по обе стороны внутренней мембраны митохондрий. Нет протонного потенциала – нет и синтеза АТФ. Недавно открыт новый класс разобщителей (ионофоры) – некоторые из них являются антибиотиками. Ионофоры способны переносить протоны через мембраны, таким образом градиент протонов исчезает и синтез АТФ не будет сопряжен с переносом протонов через мембраны. Например, антибиотик валиномицин (представляет собй циклический пептид) способен специфически захватывать ионы калия и переносить их через мембрану. При этом переносятся и протоны что приводит к падению протонного потенциала и окислительного фосфорилирования соответственно. Антибиотик грамицидин (тоже пептид) способен играть роль разобщителя, связываясь с мембраной и образуя поры через которые могут проходить ионы калия, натрия и протоны водорода. Механизм действия динитрофенола тоже связан с его способностью связывать протоны свнешней стороны внутренней мембраны, то-есть из мембранного пространства и переносить их обратно в матрикс. Действие ингибиторв постоянно проиходит и при нормальной жизнедеятельности организма, так как процессы окислительного фосфорилирования очень четко регулируются в живом организме. Есть и физиологические процессы регулирования окислительного фосфорилирования. Чем больше сопряжение, тем больший процент свободной энергии утилизируется в АТФ и наоборот. Следовательно, ингибирование может регулировать выход тепла регулированием степени сопряжения. Регуляторами степени сопряжения могут быть гормоны (инсулин повышает, тироксин уменьшает), витамины (витамин Е увеличивает), продукты метаболизма (жирные кислоты уменьшаются). Многие болезни приводят к нарушению сопряжения (это приводит, например, к повышению температуры тела у больных). Обратите внимание: 1) полный процесс окислительного фосфорилирования (ОФ) протекает внутри митохондрий; 2) основная часть АТФ- зависимых процессов происходит вне митохондрий; 3) митохондриальная мембрана непроницаема для прямой диффузии АИФ. Каким же образом АТФ покидает митохондрии? Оказывается митохондриальная мембрана содержит специальный транспортный белок для выполнения этой функции. На каждую молекулу АТФ, переносимую из митохондрии в цитоплазму, приходится молекула АДФ, перносимая из цитоплазмы внутрь митохондрии.
Утилизация
АДФ АТФ
Внешняя мембрана
 |  | ||
Транспортный
белок внутренняя мембрана
Н3РО4 + АДФ
АТФ
К нарушению энергообмена могут привести следующие причины:
1) Состояния, связанные с гипоксией. 2) Недостаток субстратов окисления.
3) Повреждение митохондрий (вследствие действия микробов, токсинов и т.д.).
Метаболизм можно определить как совокупность всех химческих реакций, происходящих в живом организме. Число различных реакций у человека составляет до нескольких тысяч. Несмотря на разнообразие химических реакций, вполне отчетливо проявляется единство процессов метаболизма. Обычно процессы метаболизма делят на катаболические и анаболические. Катаболизм относится к последовательности реакций расщепления Анаболизм относится к последовательности реакций синтеза. Соединения, образующиеся в ходе метаболических реакций (в процессе перехода исходных веществ в конечный продукт) называются метаболитами или интермедиатами. Хотя катаболические и анаболические пути во многих отношениях различаются, тем не менее они тесно связаны друг с другом, это проявляется в следующем:
1) Реакции окисления-восстановления. Большинство стадий катаболического пути включают рекции окисления, в которых принимают участие окисленные формы ко-ферментов НАД(+), НАДФ(+) и реже ФАД(+), которые в результате восстанавливаются до НАДН, НАДФН и ФАДН2. В анаболических реакциях, а это, в основном, реакции восстановления, используются восстановленные формы этих ко-ферментов (в первую очередь НАДФН), сами же ко-ферменты в ходе этих реакций окисляются.
2) Энергетика реакций: катаболизм представляет собой экзэргонический процесс, требующий АДФ и происходящий с образованием АТФ. АТФ затем служит источником энергии в эндэргонических реакциях анаболизма, в ходе которых образуется АДФ.
3) Исходные соединения, конечные продукты и промежуточные метаболиты. Конечные продукты и метаболиты, образующееся в катаболических процессах, обычно служат исходными соединениями анаболических процессов и, наоборот, соединения, получаемые в ходе анаболических процессов могут быть исходными для катаболических путей.
Все вышеуказанное позволяет сделать вывод, что катаболизм и анаболизм – это сопряженные, взаимодополняющие процессы.
Общие пути катаболизма.
Как известно основные органические вещества в клетке – белки, жиры, углеводы. Каждое из этих классов соединений в значительной мере отличается друг от друга по химическому составу, следовательно и пути синтеза и пути распада этих соединений отличаются друг от друга. Однако, необходимо отметить, что весь процесс клеточного метаболизма взаимосвязан и взаимозависим. Более того, процесыы катаболизма и анаболизма происходят одновременно, хотя и существуют сдвиги в сторону одного или другого процесса, в зависимости от потребности клетки. Общим же, связывающим звеном всех видов распада и синтеза является цикл лимонной кислоты (или цикл трикарбоновых кислот, или цикл Кребса). Ганс Кребс – определил последовательность реакций цикла. Рассмотрим процессы катаболизма. Чисто условно катаболизм основных органических веществ в организме делят на три этапа:
1) распад сложных органических веществ до мономеров (белки - аминокислоты, жиры – жирные кислоты плюс спирты, сложные углеводы - моносахара). Это специфичные пути катаболизма для каждого вида биомолекул. Энергия при этих процессах не образуется;
2) полученные на первом этапе продукты (аминокислоты, жирные кислоты и т.д.) превращаются в общие продукты катаболизма (ПВК и ацетил- КоА). Это тоже специфичные пути. При этих реакциях образуется некоторое количество энергии; 3) общие пути катаболизма. Так как различные органические соединения (белки, жиры, углеводы) имеют разную химическую структуру, то и распадаются они по-разному. Но на определенных этапах распада белков, жиров и углеводов образуются общие для всех видов распада соединения, которые либо запускают цикл Кребса, либо являются его интермедиатами. Так, углеводы при распаде превращаются в ПВК. Жирные кислоты – превращаются в ацетил - КоА. Различные аминокислоты превращаются в различные интермедиаты цикла Кребса и включаются в цикл на определенном этапе (например: аланин, треонин, глицин, цистеин, серин – превращаются в пируват; аспарагин – в оксалоацетат (ЩУК), тирозин – в фумарат; валин, метионин – в сукцинил-КоА; лейцин, изолейцин, триптофан – в ацетил-КоА и т.д.). Из всех указаных соединений, в которые превращаются белки, жиры и углеводы при распаде, только ПВК не является составной частью цикла Кребса. Однако ПВК превращается в ацетил-КоА под действием пируват ДГ-комплекса. Общую схему катаболизма мы можем представить так:
Белки Углеводы Жиры
Аминокислоты ПВК Глицерин Жирные
кислоты
Ацетил КоА
 |
Цикл Кребса
СО2 + НОН + Энергия.
Таким образом, общими путями катаболизма мы можем назвать цикл Кребса и, в какой-то мере, превращение ПВК в ацетил КоА.
Окислительное декарбоксилирование ПВК.
Большинство аэробных организмов использует углеводы в качестве основного источника углерода и энергии в ходе совместных процессов цикла Кребса и гликолиза. Сопряжение этих двух путей происходит на уровне превращения
ПВК ацетил КоА, катализируемого в митохондриях пируватдегидрогеназным комплексом (ПДК). Хотя пируват, как мы уже видели может образоваться и в ходе распада белков и жиров. ПВК образуется, в основном, в цитозоле, а реакция перехода ПВК в ацетил КоА имеет место в митохондриях. ПВК транспортируется в митохондрии с помощью специальных переносчиков. В ходе этой реакции проиходит образование тиоэфира (ацетил КоА) и окислительное декарбксилирование альфа-кето (ПВК). Полученный в результате реакции ацетил КоА поступает в цикд Кребса, где и распадается до СО2, НОН, SH-КоА + энергия. Общая схема реакции:
СН3 СН3
| ПДК |
C=O + HAD(+) + HS-KoA C=O + HADH + CO2 + H
| |
COOH S – KoA
ПВК Ацетил КоА.
ПДК состоит из трех различных ферментов, которые используют 5 различных ко-ферментов.
Е1 – ПВК-ДГ (ее называют так же пируватдекарбоксилаза). В качестве ко-фермента служит тиаминпирофосфат (фосфорилирванная форма витамина В1 - тиамина). Е1 катализирует декарбоксилирование ПВК, причем ацетильная группа переносится на тиамин пирофосфат.
NH2 N+ CH3